一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白及其应用，该重组蛋白在组织型纤溶酶原激活剂的催化结构域高活性突变体tPA

【技术实现步骤摘要】
一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白及其应用。

技术介绍

[0002]随着社会经济的发展，大众生活水平显著提高，健康问题也随之而来，根据世界卫生组织（WHO）最新发布的有关全球疾病状况的最新评估报告《2020世界卫生统计报告》（World Health Statistics 2020）显示，目前心血管疾病已经成为全球四大致死疾病之一，尤其是血栓栓塞性疾病。血栓形成已然成为全世界人类残疾和死亡的主要原因，全球接近四分之一的人死于血栓栓塞性疾病，包括中风、急性心肌梗死（AMI）、肺栓塞和动脉粥样硬化等。由此可见血栓栓塞性疾病已经成为了影响全人类健康和幸福的最大威胁。
[0003]溶栓药物被广泛应用，是治疗血栓类疾病的重要手段。根据国内外的急性缺血性脑卒中治疗指南推荐，临床上的一线溶栓药物为阿替普酶。阿替普酶是体内生理性激活剂组织型纤溶酶原激活剂（tissue
‑
type plasminogen activator，tPA）的重组蛋白（recombinant tPA, rtPA）。
[0004]tPA作为体内纤溶系统主要组成成分，与血栓基质纤维蛋白具有较强的特异性亲和力，能在血栓局部有效的激活纤溶酶原为纤溶酶而使血栓溶解。tPA的溶栓特性与其结构相关。体内初始合成的tPA是以单链形式存在，在纤溶酶存在下，单链tPA会被水解变成A链和B链，两条链由二硫键连接，A链含有
①ꢀ
F 区（第 4~50 位氨基酸，与纤连蛋白的 Finger结构同源）；
②ꢀ
E 区（第 51~87 位氨基酸，与表皮生长因子结构同源）；
③ꢀ
2个K区（K1区，第 88~176位氨基酸；K2 区，第 177~256 位氨基酸。K 区与纤溶酶原的 Kringle 结构同源）；
④ꢀ
丝氨酸水解酶SPD 区（serine protease domain,第 276~527 位氨基酸，与其他丝氨酸蛋白酶的催化区同源），含活性位点 His322，Asp371 和 Ser478。通过设计合成 tPA变异体，发现tPA上述结构域与其功能有关，如 F 区和 K2 区与 tPA 结合到纤维蛋白有关，tPA 在体内快速清除与 F 区或 E 区及糖侧链有关，tPA 酶活性与SPD 区有关。其中tPA序列Lys296
‑
His
‑
Arg
‑
Arg299介导了 tPA 被其生理抑制剂 PAI
‑
1 快速抑制失活。
[0005]虽然， rtPA是自1996年美国FDA批准用于治疗急性缺血性卒中的唯一药物，但其在临床上的应用仍然受到许多限制。第一，时间窗口小，rtPA需要在脑卒中发生的4.5个小时以内给药。第二，rtPA的使用会产生神经毒性和出血副作用，因为体内PAI
‑
1的抑制以及对纤维蛋白的非特异性作用，往往会使病人在使用纤溶酶原激活剂时加大药物用量，进而引发出血并发症。为了解决tPA的临床使用限制问题，研究者在 tPA 分子结构修饰改造方面进行了大量工作，希望得到具有更强纤溶酶原激活能力、更高纤维蛋白特异性、对PAI
‑
1具有更强耐受性和更低血浆清除率的变异体，以进一步提高 tPA 的溶栓性质。其中代表性突变体有瑞替普酶（reteplase）和替奈普酶（tenecteplase），分别为第二代和第三代重组 tPA。这些突变体的改造主要是基于tPA的结构特征。
[0006]其中瑞替普酶是天然人 tPA 蛋白的非糖基化变异体，含有其 Kringle 2 区和
SPD区（第1~3和176~527位氨基酸）。瑞替普酶生产成本低于阿替普酶，由于缺少与纤维蛋白结合有关的F结构域，其纤维蛋白特异性不如tPA，且与内皮细胞和肝细胞的亲和力也降低，故延长其在体内的半衰期。替奈普酶的分子结构在人天然tPA分子的基础上做了如下修改：将位于Kringle 1区的第103位苏氨酸和第117位天冬酰胺分别换成天冬酰胺和谷氨酰胺，将C端胰蛋白酶样蛋白水解区的第296~299位氨基酸换成4个丙氨酸。这种突变形成了一个新的糖基化位点（T103N）并去除一个原有的糖基化位点（N117Q），而四残基替代是为了逃避内源性抑制剂PAI
‑
1的抑制作用。有实验表明替奈普酶比阿替普酶对纤维蛋白的特异性更高，对PAI
‑
1耐受性更强，血浆清除率更低。
[0007]综上，临床上亟需开发溶栓效率高、纤维蛋白特异性高、半衰期长以及有效逃逸PAI
‑
1抑制的新型溶栓剂，并能安全用于治疗急性缺血性脑卒中、急性心肌梗塞、肺栓塞等血栓栓塞性疾病。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于针对上述问题，提供一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白及其应用。该重组蛋白tPA
146Y
‑
HSA
‑
FBP由tPA催化结构域高活性突变体（tPA
146Y
）与人血清白蛋白HSA以及纤维蛋白靶向肽（fibrin binding peptide，FBP）重组构成，该重组蛋白具更强的血栓靶向能力、抵抗内源性抑制剂（PAI
‑
1）抑制能力和纤溶酶原激活能力。
[0009]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白，以组织型纤溶酶原激活剂为基础，将人血清白蛋白以及纤维蛋白靶向肽在其羧基端融合，获得重组蛋白tPA
146Y
‑
HSA
‑
FBP。
[0010]一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白tPA
146Y
‑
HSA
‑
FBP，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]上述重组蛋白tPA
146Y
‑
HSA
‑
FBP的制备方法：tPA催化结构域突变体（tPA
146Y
）与人血清白蛋白HSA以及纤维蛋白靶向肽（fibrin binding peptide，FBP）融合构成重组蛋白tPA
146Y
‑
HSA
‑
FBP。
[0012]一种表达上述组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白的重组质粒，该重组质粒包含由tPA催化结构域突变体（tPA
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）、人血清白蛋白HSA基因以及纤维蛋白靶向肽FBP基因组成的融合基因。
[0013]上述人血清白蛋白HSA基因的序列如SEQ ID NO.2所示；纤维蛋白靶向肽FBP基因由两条互补序列退火互补形成；所述两条互补序列为：F4: 5
’‑
GTGGAAGAGCCTCAGGGTGGTTTTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTTGGGAATG TCCATACGGTTTGTGTTGGATT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白以组织型纤溶酶原激活剂为基础，将人血清白蛋白以及纤维蛋白靶向肽在其羧基端融合，获得重组蛋白tPA
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‑
HSA
‑
FBP。2.根据权利要求1所述一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.如权利要求2所述的一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白的制备方法，其特征在于：tPA催化结构域突变体tPA
146Y
与人血清白蛋白HSA以及纤维蛋白靶向肽FBP融合构成重组蛋白。4.一种表达如权利要求2所述组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒由tPA催化结构域突变体tPA
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质粒tPA
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pPICZαA连接人血清白蛋白HSA基因以及纤维蛋白靶向肽FBP基因构建而成。5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于：所述人血清白蛋白HSA基因的序列如SEQ ID NO.2所示；所述纤维蛋白靶向肽FBP基因序列由两条互补序列退火互补形成；所述两条互补序列为：F4: 5
’‑
GTGGAAGAGCCTCAGGGTGGTTTTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTTGGGAATG TCCATACGGTTTGTGTTGGATTCAA
‑3’
;R4:5
’‑
TTGAATCCAACACAAACCGTATGGACATTCCCAAGAACCACCACCACCAGAAC CACCACCACCTGGCGCGCCGAC
‑3’
。6.如权利要求4所述重组质粒的构建方法，其特征在于：以LIC法将HSA基因片段连接至tPA
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‑
pPICZαA突变体质粒上，构建质粒tPA
146Y
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HSA
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pPICZαA，然后将FBP...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄明东，许燕艳，袁彩，徐芃，江龙光，陈丹，陈珊莉，蒋大林，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：