经基因组编辑的细胞的制造方法技术

一种仅单侧等位基因经基因组编辑的细胞的制造方法，包括将(A)和(B)导入细胞的工序，所述(A)为选自由(a1)在间隔序列的5

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经基因组编辑的细胞的制造方法


[0001]本专利技术涉及基因组编辑的领域。本专利技术尤其涉及仅单侧等位基因经基因组编辑的细胞的制造方法、能够在该制造方法中使用的向导RNA、表达载体及试剂盒、以及基因组编辑模式的预测方法。进而，本专利技术涉及基因组编辑模式的分析方法以及能够在该分析方法中使用的细胞。
[0002]本申请基于在2018年12月12日在日本申请的日本特愿2018
‑
232946号要求优先权，并将其内容援引于此。

技术介绍

[0003]已知成簇的规则排列的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats：CRISPR)和Cas(CRISPR
‑
相关)基因一起构成适应性免疫系统，该系统在细菌和古细菌中提供针对侵入外源核酸的获得性抗性。CRISPR往往是由噬菌体或质粒DNA引起的，由24～48bp的短保守重复序列(其间插入有大小类似的被称作间隔序列的独特可变DNA序列)构成。另外，在重复序列和间隔序列的附近存在编码Cas蛋白家族的基因组。
[0004]在CRISPR
‑
Cas系统中，外源性DNA被Cas蛋白家族切割成30bp左右的片段，并插入CRISPR中。作为Cas蛋白家族之一的Cas1和Cas2蛋白识别外源性DNA的被称作前间隔序列邻近基序(proto
‑
spacer adjacent motif，PAM)的碱基序列，切取其上游，插入到宿主的CRISPR序列中，这成为细菌的免疫记忆。包含免疫记忆的CRISPR序列被转录而生成的RNA(称作pre
‑
crRNA。)与部分互补的RNA(反式激活crRNA(trans
‑
activating crRNA：tracrRNA))配对，被摄入到作为Cas蛋白家族之一的Cas9蛋白中。摄入到Cas9中的pre
‑
crRNA及tracrRNA被RNaseIII切割，成为包含外源序列(向导序列)的小的RNA片段(CRISPR
‑
RNAs：crRNAs)，形成Cas9
‑
crRNA
‑
tracrRNA复合体。Cas9
‑
crRNA
‑
tracrRNA复合体与同crRNA互补的外源侵入性DNA结合，切割DNA的酶(核酸酶)即Cas9蛋白切割外源侵入性DNA，从而抑制和排除外来侵入的DNA的功能。
[0005]Cas9蛋白识别外源侵入性DNA中的PAM序列，在其上游切割双链DNA使其形成平滑末端。PAM序列的长度或碱基序列根据细菌种类的不同而多种多样，在酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(S.pyogenes)中识别“NGG”这3个碱基。嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(S.thermophilus)持有2个Cas9，分别将“NGGNG”或“NNAGAA”这5～6个碱基识别为PAM序列。(N表示任意的碱基)。切割PAM序列上游的几bp的位置也根据细菌种类而不同，但包含S.pyogenes的大部分的Cas9直系同源物切割PAM序列的上游3个碱基。
[0006]近年来，正在积极开发将细菌中的CRISPR
‑
Cas系统应用于基因组编辑的技术。使crRNA与tracrRNA融合而作为tracrRNA
‑
crRNA嵌合体来表达，并进行有效利用。由此，称为RNA诱导型核酸酶(RNA
‑
guided nuclease：RGN)，并在目标部位切割基因组DNA。
[0007]CRISPR
‑
Cas系统有I、II、III型，但在基因组编辑中专门使用II型CRISPR/Cas系
统，在II型中使用Cas9蛋白作为RGN。由于来自S.pyogenes的Cas9蛋白识别NGG这3个碱基作为PAM序列，因此只要存在并列有2个鸟嘌呤的序列，就可切割其上游。
[0008]使用CRISPR
‑
Cas系统的方法不仅可以合成具有与靶DNA序列相同的序列的短gRNA，还可以使用作为单一蛋白的Cas9蛋白进行基因组编辑。因此，无需像以往使用的锌指核酸酶(ZFN)或类反式激活因子激动剂(TALEN)那样对每个DNA序列合成不同大小的蛋白，能够简便且迅速地进行基因组编辑。
[0009]例如，在专利文献1中公开了有效利用来自S.pyogenes的CRISPR/Cas系统的基因组编辑技术。
[0010]现有技术文献
[0011]专利文献
[0012]专利文献1：国际公开第2014/093661号

技术实现思路

[0013]专利技术所要解决的技术问题
[0014]已知通过基因组编辑已切割双链的DNA可通过同源重组修复(Homologous Directed Repair：HDR)或非同源末端连接修复(Non
‑
Homologous End
‑
Joining Repair：NHEJ)来进行修复。在NHEJ时，由于在修复时高频率地诱导插入和/或缺失(insertion/deletion：indel)，因此有发生无法预期的基因变异的风险。
[0015]例如在杂合有疾病基因和正常基因的情况下，若想要通过基因组编辑来敲除疾病基因，则有在正常基因中也高频率地诱导变异的风险。另外，即便想要通过HDR来敲入正常基因，在两等位基因中发生敲入的概率也极低。因此，在未诱导敲入的等位基因中有因NHEJ而导入indel的风险。
[0016]因此，在通过基因组编辑而在两等位基因中发生双链切割的情况下，有在单侧的等位基因中诱导无法预期的变异的风险。
[0017]本专利技术是鉴于上述情况而完成的，其目的在于提供仅单侧等位基因经基因组编辑的细胞的制造方法、以及能够在上述方法中使用的向导RNA、表达载体、试剂盒。进而，其目的还在于提供基因组编辑模式的预测方法、以及基因组编辑模式的分析方法及能够在上述分析方法中使用的细胞。
[0018]用于解决技术问题的方案
[0019]本专利技术包含以下方案。
[0020][1]一种仅单侧等位基因经基因组编辑的细胞的制造方法，其中，包括将(A)和(B)导入细胞的工序，所述(A)为选自由(a1)在间隔序列的5
’
末端添加有1个以上核苷酸残基的向导RNA、(a2)包含相对于靶序列具有1个碱基或多个碱基错配的间隔序列的向导RNA、及(a3)所述(a1)或所述(a2)的向导RNA的表达载体组成的组中的至少1种，所述(B)为选自由Cas蛋白及其表达载体组成的组中的至少1种。
[0021][2]根据[1]所述的仅单侧等位基因经基因组编辑的细胞的制造方法，其中，所述(A)是在间隔序列的5
’
末端添加1个以上核苷酸残基且所述间隔序列是本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种仅单侧等位基因经基因组编辑的细胞的制造方法，其中，包括将(A)和(B)导入细胞的工序，所述(A)为选自由(a1)在间隔序列的5
’
末端添加有1个以上核苷酸残基的向导RNA、(a2)包含相对于靶序列具有1个碱基或多个碱基错配的间隔序列的向导RNA、及(a3)所述(a1)或所述(a2)的向导RNA的表达载体组成的组中的至少1种，所述(B)为选自由Cas蛋白及其表达载体组成的组中的至少1种。2.根据权利要求1所述的仅单侧等位基因经基因组编辑的细胞的制造方法，其中，所述(A)是在间隔序列的5
’
末端添加1个以上核苷酸残基且所述间隔序列是相对于靶序列具有1个碱基或多个碱基错配的间隔序列的、向导RNA或编码该向导RNA的表达载体。3.根据权利要求1或2所述的仅单侧等位基因经基因组编辑的细胞的制造方法，其中，被添加至所述间隔序列的5
’
末端的核苷酸残基全部为相同的核苷酸残基。4.根据权利要求3所述的仅单侧等位基因经基因组编辑的细胞的制造方法，其中，被添加至所述间隔序列的5
’
末端的核苷酸残基为胞嘧啶残基或鸟嘌呤残基。5.根据权利要求1～4中任一项所述的仅单侧等位基因经基因组编辑的细胞的制造方法，其还包括将(C)供体载体导入细胞的工序。6.根据权利要求1～5中任一项所述的仅单侧等位基因经基因组编辑的细胞的制造方法，其中，所述Cas蛋白为Cas9蛋白。7.一种向导RNA，其在间隔序列的5
’
末端添加有1个以上的核苷酸残基。8.根据权利要求7所述的向导RNA，其中，所述间隔序列相对于靶序列具有1个碱基或多个碱基的错配。9.一种权利要求7或8所述的向导RNA的表达载体。10.根据权利要求9所述的表达载体，其还能表达Cas蛋白。11.根据权利要求10所述的表达载体，其中，所述Cas蛋白为Cas9蛋白。12.一种仅单侧等位基因经基因组编辑的细胞的制造试剂盒，其中，包含(A)，所述(A)为选自由(a1)在间隔序列的5
’
末端添加有1个以上...

【专利技术属性】
技术研发人员：铃木淳史，川又理树，
申请(专利权)人：国立大学法人九州大学，
类型：发明
国别省市：