靶向外泌体的双特异性抗体制造技术

本文所述的发明专利技术涉及双特异性抗体，其能够通过特异性结合第一外泌体相关蛋白和作为第二外泌体相关蛋白的程序性死亡配体

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】靶向外泌体的双特异性抗体


[0001]本专利技术的领域涉及用于治疗癌症的基于抗体的疗法。

技术介绍

[0002]人适应性免疫系统通过细胞(T细胞)和体液(B细胞)过程二者对抗原攻击作出应答。体液应答导致表达能够与抗原结合的表面结合免疫球蛋白(Ig)分子的B细胞的选择和克隆扩增。T细胞由未成熟的前体发育而来，所述未成熟的前体来源于骨髓，并且然后迁移到胸腺，在那里它们增殖并分化为成熟的T淋巴细胞。
[0003]体液应答的发展包括与克隆扩增一致发生的体细胞超突变(somatic hypermutation)和类别转换的过程。这些过程一起导致分泌的抗体已经针对靶抗原进行了亲和力成熟，并包含属于四个一般类别(M、D、A、G或E)之一的恒定结构域。每一类抗体(IgM、IgD、IgA、IgG和IgE)以不同的方式与细胞免疫系统相互作用。已经针对靶抗原进行了亲和力成熟的抗体的标志可包括：1)相对于种系基因，核苷酸和随后的氨基酸的变化，2)对靶抗原的高结合亲和力，3)与其他蛋白质相比，对靶抗原的结合选择性。
[0004]众所周知，肿瘤患者可以引起针对肿瘤细胞抗原的免疫应答。这些抗原可能由于肿瘤内的遗传变化引起，其导致突变的蛋白质或导致其他方面正常的蛋白质对免疫系统的异常呈递。异常呈递可以通过包括但不限于以下的过程发生：新生蛋白质(neonatal protein)的异位表达，细胞内蛋白质错误定位于细胞表面，或细胞裂解。导致蛋白质糖基化变化的酶的异常表达也可以导致产生被体液免疫系统识别的非自身抗原。
[0005]已经证明选择性结合疾病相关蛋白(包括与癌症相关的那些)的抗体以导致治疗功效的方式成功地调节其靶蛋白的功能。人免疫系统引起针对突变或其他方面异常的蛋白质的抗体应答的能力表明，患者的免疫应答可以包括能够识别和调节关键肿瘤驱动程序功能的抗体。就此而言，参与细胞膜运输的蛋白质表达的升高与肿瘤生长和肿瘤转移升高有关。
[0006]膜运输有助于调节许多各种细胞过程。细胞表面受体的内化是适当调节生长因子受体介导的信号传导的关键机制。通过网格蛋白包被囊泡的内化代表了癌症相关受体从细胞表面内化的一种途径。将这些受体装载到网格蛋白包被小窝(clathrin
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coated pit)(CCP)中以随后在网格蛋白包被囊泡中内化是该途径的第一步。受体向CCP中的装载部分地取决于与衔接子分子(例如Epsin
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1(EPN1))的相互作用。
[0007]EPN1是定位在细胞膜上的约60.3kDa的蛋白质。其包含PI(4,5)P2
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、泛素
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和网格蛋白/AP
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2相互作用结构域。敲低EPN1内源表达的表达，使EPN1的突变形式过表达或用旨在阻断EPN1与其货物分子相互作用的试剂处理细胞，可以抑制已知的CCP依赖性货物的内化。这样的货物的实例是VEGFR和ERBB3。明显地，某些类型的癌肿瘤细胞释放装载EPN1的外泌体，并且可以通过阻断EPN1与其受体相互作用来阻止这样的细胞的生长。
[0008]初始的成熟的T细胞离开胸腺并迁移到专门的淋巴器官，例如淋巴结、脾脏和扁桃体。如果初始T细胞接收到活化信号，其将经历多轮分裂以产生效应细胞群以及另
(“EPN1”)、CD9、CD10、CD26、CD37、CD45/ICAM
‑
1、CD63、CD69、CD81、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、筏蛋白
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1(Flotillin
‑
1)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖
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1(Glypican
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1)、HER2、HER3、HSP70、HSP90和NKCC2。
[0017]根据本专利技术的双特异性抗体的第二结合部分可以来源于任何PD
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L1
‑
特异性抗体，包括PD
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L1
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特异性抗体的VH和VL链，所述抗体例如但不限于阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)或BMS 936559。
附图说明
[0018]图1是B7家族的T细胞共刺激分子的图示；
[0019]图2显示了通过流式细胞术测定的外泌体与抗CD63包被的珠的剂量依赖性结合。用荧光标记的抗CD63抗体检测与抗CD63珠结合的外泌体；
[0020]图3显示了当通过流式细胞术评估结合时，通过吸附而被捕获在乳胶珠上的外泌体与抗EPN1抗体IMM20059具有反应性。相比之下，IMM20059不与BSA包被的珠结合；
[0021]图4显示了利用Attune
TM
NxT仪器(生命科技公司(Life Technologies))通过流式细胞术观察到的IMM20059与完整A549肺癌细胞系结合的浓度依赖性结合曲线。用荧光团标记的抗人第二抗体检测IMM20059与完整细胞的结合；
[0022]图5显示了利用Attune
TM
NxT仪器(生命科技公司)通过流式细胞术观察到的IMM20059与完整Huh7肝癌细胞结合的浓度依赖性结合曲线。用荧光团标记的抗人第二抗体(Abs)检测IMM20059与完整细胞的结合；
[0023]图6显示了定量斑点印迹结果，其描述了相对于其同源物EPN2，IMM20059对EPN1的选择性。通过针对浓度增加的重组EPN1或EPN2的斑点印迹来分析IMM20059的结合；
[0024]图7显示了流式细胞术分析，表明IMM20059与鼠EPN1抗原交叉反应。进行了鼠NIH3T3和人MFE296细胞系细胞的表面和细胞内染色。在两种细胞系的库中观察到IMM20059的细胞表面和细胞内结合。已知与小鼠和人EPN1二者交叉反应的市售抗EPN1抗体类似地与NIH3T3和MFE296细胞结合。但是，在两个细胞库中，市售抗体无法与细胞表面的EPN1相互作用；
[0025]图8是两种单特异性IgG抗体和由分离自两种不同IgG抗体中的每一种的可变结构域产生的双特异性抗体的卡通表示；
[0026]图9是卡通表示，表明双特异性抗EPN1/抗PDL1抗体将与包含两种标志物的外泌体结合；
[0027]图10显示了斑点印迹结果，表明双特异性抗体内抗PD
‑
L1可变结构域的位置影响抗体与PD
‑
L1结合的能力，但不影响与EPN1结合的能力；
[0028]图11显示了利用Attune
TM
NxT仪器(生命科技公司)通过流式细胞术观察到的Ate/PR045
‑
2H11:L抗EPN1/抗PD
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L1双特异性抗体与完整A549肺癌细胞系的浓度依赖性结合曲线。用荧光团标记的抗人第二抗体检测IMM20059与完整细胞的结合。
具体实施方式
[0029]本文所述的专利技术涉及能够通过特异性结合第本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种双特异性抗体，其包含：(A)对外泌体蛋白质具有特异性的第一抗原结合部分，以及(B)对程序性细胞死亡配体1(PD
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L1)具有特异性的第二抗原结合部分。2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合部分包含：(1)以下项中的至少一种：(a)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链互补决定区(“CDR”)1；(b)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链CDR3；以及(2)以下项中的至少一种：(a)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链CDR1；(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链CDR3。3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合部分包含选自阿特珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗和BMS
‑
936559的抗PD
‑
L1抗体的V
H
链或其片段和V
L
链或其片段。4.根据权利要求1至3中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合部分特异性结合选自以下项的外泌体蛋白质：EPN1、CD9、CD10、CD26、CD37、CD45/ICAM
‑
1、CD63、CD69、CD81、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、筏蛋白
‑
1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖
‑
1、HER2、HER3、HSP70、HSP90和NKCC2。5.根据权利要求4所述的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合部分特异性结合人EPN1上的表位。6.根据权利要求5所述的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合部分包含：(1)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的可变重链或其片段；和(2)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的可变轻链或其片段。7.根据权利要求5所述的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合部分包含：(1)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的可变重链或其片段；和(2)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可变轻链或其片段。8.根据权利要求5所述的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合部分包含：(1)以下项中的至少一种：(a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；(b)包...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：伊米若梅有限公司，
类型：发明
国别省市：