ETV4基因在重编程增生性瘢痕成纤维细胞中的应用制造技术

本发明专利技术公开了ETV4基因在重编程增生性瘢痕成纤维细胞中的应用，属于医药技术领域。本发明专利技术经过研究发现，ETV4基因可以用于重编程增生性瘢痕成纤维细胞，既开拓了ETV4基因新的应用领域，也开拓了新的重编程增生性瘢痕成纤维细胞的基因，具有积极的药学价值和广泛的社会意义。意义。意义。

【技术实现步骤摘要】
ETV4基因在重编程增生性瘢痕成纤维细胞中的应用


[0001]本专利技术涉及ETV4基因在重编程增生性瘢痕成纤维细胞中的应用，属于医药


技术介绍

[0002]增生性瘢痕成纤维细胞(Hypertrophic scar fibroblasts，简称HSF)在创面愈合过程中被过度激活，产生大量的细胞外基质，使其在细胞外过度沉积，是导致增生性瘢痕形成的重要原因。在增生期瘢痕中，成纤维细胞合成和分泌胶原能力增强，特别是Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量远远高于正常皮肤。应用细胞生物学技术使瘢痕肌成纤维细胞逆转为成纤维细胞或转化为其它细胞，减少Ⅰ、Ⅲ型胶原产生，重塑细胞外基质，为瘢痕的治疗开辟了新方向。如何调控瘢痕成纤维细胞表型改变是目前瘢痕治疗的研究热点。
[0003]ETV4(英文全称为ETS translocation variant 4)基因，属于ETS(E26 translocation
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specific)转录因子家族，又叫做PEA3或E1AF。目前，ETV4基因相关的研究主要集中在其与肿瘤局部侵袭和远处转移之间的关系，例如：在一种低转移性的乳腺癌细胞MCF7中过表达ETV4，则会导致其侵袭性增加；而在肿瘤细胞中敲低ETV4的表达，则会导致肿瘤侵袭性降低。但是，ETV4基因与增生性瘢痕成纤维细胞之间的关联性，目前并没有相关报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供ETV4基因在重编程增生性瘢痕成纤维细胞中的应用。
[0005]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：ETV4基因在重编程增生性瘢痕成纤维细胞中的应用。
[0006]本专利技术的原理是：
[0007]本专利技术分别检测增生性瘢痕成纤维细胞及正常真皮成纤维细胞中mRNA表达水平，发现增生性瘢痕成纤维细胞中ETV4表达明显低于正常真皮成纤维细胞。通过构建ETV4过表达慢病毒载体，转染人增生性瘢痕成纤维细胞，使其Ⅰ、Ⅲ型胶原表达明显下调，在体外实现改善瘢痕的作用。因此，ETV4基因可以用于重编程增生性瘢痕成纤维细胞，既开拓了ETV4基因新的应用领域，也开拓了新的重编程增生性瘢痕成纤维细胞的基因，具有积极的药学价值和广泛的社会意义。
[0008]本专利技术的有益效果是：
[0009]本专利技术经过研究发现，ETV4基因可以用于重编程增生性瘢痕成纤维细胞，既开拓了ETV4基因新的应用领域，也开拓了新的重编程增生性瘢痕成纤维细胞的基因，具有积极的药学价值和广泛的社会意义。
[0010]在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。
[0011]进一步，所述重编程增生性瘢痕成纤维细胞的方法是：
[0012]步骤1：取新鲜的人增生性瘢痕标本，进行组织消化，分离获取增生性瘢痕成纤维细胞；
[0013]步骤2：将如SEQ ID No.1所示的人ETV4基因CDS区编码序列连接至pCDH质粒载体上，获取pCDH
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ETV4过表达质粒并进行扩增；
[0014]步骤3：将目的基因ETV4质粒、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染HEK 293T细胞，收集病毒上清，浓缩后，获得慢病毒悬液；
[0015]步骤4：取步骤1的增生性瘢痕成纤维细胞，培养传至第3代，得到P3代增生性瘢痕成纤维细胞，待细胞融合至70％
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80％，用步骤3的慢病毒悬液进行感染，72h后，即得到经过ETV4基因重编程的增生性瘢痕成纤维细胞。
[0016]采用上述进一步的有益效果是：通过上述操作，可以获得过表达ETV4基因的增生性瘢痕成纤维细胞。
[0017]更进一步，步骤1中，所述组织消化的具体方法是：取新鲜的人增生性瘢痕标本，用无菌PBS清洗后剪成细条状，放入质量百分数为0.25％的中性蛋白酶溶液中，置于37℃孵育2h后分离表皮与真皮；取真皮组织剪碎呈泥状，加入到10倍体积的质量百分数为0.2％的I型胶原酶溶液中，置于37℃摇床中，采用转速为80rpm
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100rpm，孵育2h，即得。
[0018]采用上述进一步的有益效果是：通过上述步骤，可以将增生性瘢痕组织进行消化，以便进一步分离出其中的瘢痕成纤维细胞。
[0019]更进一步，步骤1中，所述分离是采用70μm滤网过滤后，300g离心5min，加入5mL含10％胎牛血清的DMEM低糖培养基重悬，接种于细胞培养皿内，在37℃，5％CO2培养箱中培养。
[0020]采用上述进一步的有益效果是：通过上述方式，可以获得活性良好的原代增生性瘢痕成纤维细胞，更有利于进一步实验的开展。
附图说明
[0021]图1为倒置显微镜下，增生性瘢痕成纤维细胞原代HSF培养48h的形态。
[0022]图2为倒置显微镜下，增生性瘢痕成纤维细胞3代HSF培养48h的形态。
[0023]图3为ETV4插入质粒载体pCDH
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CMV
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MCS
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EF1
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Puro的位置；
[0024]图4为过表达质粒ETV4
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PCDH琼脂糖电泳图谱，XbaI和NheI酶切图谱；其中，通道1为质粒DNA；通道2为用NdeI/NheI酶切；通道M为DNA标记；
[0025]图5为倒置荧光显微镜下，观察PCDH
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ETV4载体转染HEK 293T细胞的照片；
[0026]图6为倒置荧光显微镜下，观察PCDH
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ETV4病毒感染HSF细胞的照片；
[0027]图7为倒置显微镜下，观察PCDH病毒感染HSF细胞的照片；
[0028]图8为倒置显微镜下，观察PCDH
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ETV4病毒感染HSF细胞的照片；
[0029]图9为慢病毒感染后HSF的ETV4基因表达水平
[0030]图10为过表达ETV4的HSF纤维化相关基因mRNA表达水平；
[0031]图11为过表达ETV4的HSF纤维化相关基因蛋白表达水平。
具体实施方式
[0032]以下结合具体附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发
明，并非用于限定本专利技术的范围。
[0033]实施例1：质粒构建和细胞培养
[0034]1.1增生性瘢痕成纤维细胞的分离培养
[0035]取新鲜的人增生性瘢痕标本，所有增生性瘢痕的获取均得到整形外科医院伦理委员会的批准，并取得患者及家属的知情同意。用无菌PBS清洗2次后剪成细条状，放入质量百分数为的0.25％中性蛋白酶溶液中，置于37℃孵育2h后分离表皮与真皮，取真皮组织剪碎呈泥状。将剪碎的真皮组织加入到10倍体积的质量百分数为0.2％的I型胶原酶溶液，置于37℃摇床中孵育2h，转速为80rpm
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100rpm。待瘢痕组织消化完全后(观察无块状组织即可)，用70μm滤网过滤，300g离心5min，加入5mL含10％胎牛血本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.ETV4基因在重编程增生性瘢痕成纤维细胞中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重编程增生性瘢痕成纤维细胞的方法是：步骤1：取新鲜的人增生性瘢痕标本，进行组织消化，分离获取增生性瘢痕成纤维细胞；步骤2：将如SEQ ID No.1所示的人ETV4基因CDS区编码序列连接至pCDH质粒载体上，获取pCDH
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ETV4过表达质粒并进行扩增；步骤3：将目的基因ETV4质粒、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染HEK 293T细胞，收集病毒上清，浓缩后，获得慢病毒悬液；步骤4：取步骤1的增生性瘢痕成纤维细胞，培养传至第3代，得到P3代增生性瘢痕成纤维细胞，待细胞融合至70％
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80％，用步骤3的慢病毒悬液进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：代强，于倩，蔡磊，肖苒，
申请(专利权)人：中国医学科学院整形外科医院，
类型：发明
国别省市：