抗体功能化的外泌体制剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种抗体功能化的外泌体制剂及其制备方法和应用。所述外泌体制剂是以特定的肿瘤抗原Ag激活的树突状细胞的外泌体Exo

【技术实现步骤摘要】
抗体功能化的外泌体制剂及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及肿瘤免疫治疗药物
，具体地说是一种抗体功能化的外泌体制剂及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]CAR
‑
T细胞疗法又叫嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，它属于过继性T细胞转移的一种。CAR
‑
T细胞疗法作为一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，它能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症，是一种极具前景的新型肿瘤免疫治疗方法。然而，广泛的研究揭示了CAR
‑
T细胞免疫疗法中存在的局限性。
[0003]CAR
‑
T细胞疗法的原理是利用病人自身的免疫细胞实现对癌细胞的清除，其主要目的是加强免疫系统内在的抗癌能力。CAR
‑
T细胞疗法是从患者的血液中提取T细胞，并在体外对这些细胞进行基因改造，给它们装上识别癌细胞表面抗原的“嵌合抗原受体”（CAR）。随后，将这些改造之后的细胞进行大量扩增，再输注回患者体内，从而达到识别、杀死癌细胞的治疗效果。CAR
‑
T细胞的嵌合抗原受体(CAR)是由胞外抗原结合域、铰链区、跨膜区和胞内结构域组成的。当把重新编码后的T细胞回输进患者体内后，这种嵌合抗原受体就像“定位导航装置”一样可以特异性地追踪和识别并引导T细胞杀伤肿瘤细胞。
[0004]对目前来说，CAR
‑
T细胞发展仍未完善，仍有诸多问题有待解决。首先，肿瘤表面抗原的缺失导致的抗性作用以及CAR
‑
T的功能持久性较差，仍可能导致疾病进展。其次，大剂量CAR
‑
T细胞输注后可能会引发细胞因子释放综合征等严重的副作用，这也是CAR
‑
T技术在临床应用中一个最主要的不良反应。此外，体外改造、扩增并回输患者T细胞的操作非常费力且费用高也是CAR
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T疗法的应用限制之一。且由于不同患者T细胞反应、持续性和副作用的不同，预测最佳输注细胞数也是一个挑战。更值得注意的是，由于肿瘤促结缔组织增生的特性和免疫抑制的肿瘤微环境使得CAR
‑
T细胞通常在肿瘤中的浸润效率较低，以至于CAR
‑
T细胞疗法对于实体瘤的治疗效果并不理想。因此，能够克服CAR
‑
T细胞疗法中的应用障碍的设计策略对于增强其临床应用价值具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的就是提供一种抗体功能化的外泌体制剂及其制备方法和应用，以解决现有CAR
‑
T细胞疗法存在的体外改造扩增T细胞操作繁琐、储存/运输稳定性低、脱靶、保留率低等的问题。
[0006]本专利技术的目的是这样实现的：一种抗体功能化的外泌体制剂，所述外泌体制剂是以特定的肿瘤抗原Ag激活的树突状细胞的外泌体Exo
‑
Ag为载体，利用磷脂
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聚乙二醇
‑
琥珀酰亚胺酯DSPE
‑
PEG
‑
NHS为交联剂，将抗CD3抗体aCD3和抗EGFR抗体aEGFR修饰到外泌体Exo
‑
Ag表面而得到的外泌体制剂Exo
‑
Ag
‑
aCD3/aEGFR。
[0007]所述树突状细胞为骨髓来源的树突状细胞、DC2.4细胞系、外周血树突状细胞中的至少一种。
[0008]所述特定的肿瘤抗原Ag为OVA抗原、黑色素瘤相关抗原 MAGE以及通过细胞或组织破碎提取出的黑色素瘤特异性抗原中的至少一种。
[0009]上述的外泌体制剂的制备方法，包括以下步骤：（a）培养树突状细胞：将保存的树突状细胞进行活化并接种于培养皿中，在含5% CO2的37℃细胞培养箱中培养；（b）提取外泌体：将特定的肿瘤抗原Ag与树突状细胞共孵育，孵育完成后，收集细胞培养上清液，利用梯度离心法，除去细胞碎片和大颗粒蛋白杂质，之后利用超滤离心管进行浓缩除杂，得到外泌体溶液Exo
‑
Ag；（c）抗体修饰Exo
‑
Ag：将磷脂
‑
聚乙二醇
‑
琥珀酰亚胺酯DSPE
‑
PEG
‑
NHS溶于DMSO中，将经洗涤后的抗体aCD3和抗体aEGFR分别与DSPE
‑
PEG
‑
NHS溶液混合，其中，抗体aCD3或抗体aEGFR 与DSPE
‑
PEG
‑
NHS的摩尔比为1∶1
‑
3，混合后在2
‑
4℃条件下持续搅拌反应20
‑
28h；反应完成后离心除去未反应的DSPE
‑
PEG
‑
NHS，分别得到DSPE
‑
PEG
‑
NHS
‑
aCD3溶液和DSPE
‑
PEG
‑
NHS
‑
aEGFR溶液；将DSPE
‑
PEG
‑
NHS
‑
aCD3溶液和DSPE
‑
PEG
‑
NHS
‑
aEGFR溶液与Exo
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Ag于 2
‑
4℃条件下反应2
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4h，使DSPE
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PEG
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NHS
‑
aCD3和DSPE
‑
PEG
‑
NHS
‑
aEGFR的DSPE端插入到外泌体的膜磷脂双分子层中，从而得到成功修饰aCD3和aEGFR的外泌体制剂Exo
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Ag
‑
aCD3/aEGFR。
[0010]步骤（a）中，将冻存的树突状细胞取出，在37℃水浴锅内使其融化，然后移入EP管中，加入预热的1640完全培养基，吹匀后进行离心，弃上清液，再加入1640完全培养基，并吹匀后接种于培养皿中进行培养。
[0011]步骤（b）中，将0.1
‑
0.5 mg/mL 的肿瘤抗原Ag与树突状细胞共孵育12
‑
24h后，更换新鲜培养基48 h后收集细胞培养上清液进行过滤。
[0012]步骤（c）中，利用10 KDa超滤离心管除去过量的DSPE
‑
PEG
‑
NHS，随后将抗体aCD3和抗体aEGFR的溶液超速离心除去溶剂，并用PBS洗涤并溶解后回收备用。
[0013]上述的外泌体制剂在靶向抗肿瘤药物中的应用。
[0014]所述药物为注射剂，所述药物包含外泌体制剂Exo
‑
Ag
‑
aCD3/aEGFR。
[0015]本专利技术根据CAR
‑
T细胞的胞内、外结构域的作用，利用功能化的树突细胞外泌体作为中间体，经过肿瘤特异性抗原活化、具有靶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗体功能化的外泌体制剂，其特征是，所述外泌体制剂是以特定的肿瘤抗原Ag激活的树突状细胞的外泌体Exo
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Ag为载体，利用磷脂
‑
聚乙二醇
‑
琥珀酰亚胺酯DSPE
‑
PEG
‑
NHS为交联剂，将抗CD3抗体aCD3和抗EGFR抗体aEGFR修饰到外泌体Exo
‑
Ag表面而得到的外泌体制剂Exo
‑
Ag
‑
aCD3/aEGFR。2.根据权利要求1所述的外泌体制剂，其特征是，所述树突状细胞为骨髓来源的树突状细胞、DC2.4细胞系、外周血树突状细胞中的至少一种。3.根据权利要求1所述的外泌体制剂，其特征是，所述特定的肿瘤抗原Ag为OVA抗原、黑色素瘤相关抗原 MAGE以及通过细胞或组织破碎提取出的黑色素瘤特异性抗原中的至少一种。4.权利要求1所述的外泌体制剂的制备方法，其特征是，包括以下步骤：（a）培养树突状细胞：将保存的树突状细胞进行活化并接种于培养皿中，在含5% CO2的37℃细胞培养箱中培养；（b）提取外泌体：将特定的肿瘤抗原Ag与树突状细胞共孵育，孵育完成后，收集细胞培养上清液，利用梯度离心法，除去细胞碎片和大颗粒蛋白杂质，之后利用超滤离心管进行浓缩除杂，得到外泌体溶液Exo
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Ag；（c）抗体修饰Exo
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Ag：将磷脂
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聚乙二醇
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琥珀酰亚胺酯DSPE
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PEG
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NHS溶于DMSO中，将经洗涤后的抗体aCD3和抗体aEGFR分别与DSPE
‑
PEG
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NHS溶液混合，其中，抗体aCD3或抗体aEGFR与DSPE
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PEG
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NHS的摩尔比为1∶1
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3，混合后在2
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4℃条件下持续搅拌反应20
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28h；反应完成后离心除去未反应的DSPE
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PEG
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NHS，分别得到DSPE
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【专利技术属性】
技术研发人员：李振华，张金超，樊淼，刘会芳，
申请(专利权)人：河北大学，
类型：发明
国别省市：