一种基于固相萃取检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于固相萃取检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法。所述方法包括单克隆抗体注射液的预处理和高效液相色谱检测的步骤；所述预处理的具体步骤如下：将所述单克隆抗体注射液上样至平衡后的固相萃取柱，收集初始流出液，再使用淋洗液进行淋洗，收集后续流出液，而后将所得初始流出液与后续流出液混合，浓缩干燥后复溶，得到待测样品；其中，所述固相萃取柱的填料为以Protein A为配基的亲和层析介质。该方法通过以ProteinA为介质的固相萃取技术，消除了单克隆抗体对吐温80检测结果的干扰，同时固相萃取与流动注射HPLC相结合，使得操作方法更加便捷，检测周期短，数据重现性好。据重现性好。据重现性好。

【技术实现步骤摘要】
一种基于固相萃取检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法


[0001]本专利技术属于生物药分析检测
，具体涉及一种吐温80的检测方法，尤其涉及一种基于固相萃取检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法。

技术介绍

[0002]吐温80(Tween
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80)又名聚山梨酯80，其化学名为聚氧乙烯20山梨醇酐单油酸酯。吐温80作为助溶剂、乳化剂和稳定剂，常用于治疗性单克隆抗体注射液制剂中。由于近年来关于吐温80能够诱发过敏反应的报道越来越多，因此建立一种准确有效的吐温80含量的测定方法尤为重要。
[0003]目前，用于检测吐温80含量的方法主要有比色法、HPLC
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蒸发光散射(ELSD)检测法、水解法、质谱法和HPLC
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荧光(FLD)法等。
[0004]比色法因对设备要求比较低而应用广泛，例如，CN107300555A公开了一种快速高效测定吐温80含量的比色方法。该方法系在水性介质中，使吐温80的聚乙氧基与硫氰酸钴铵盐在沸水浴加热条件下快速显色反应，定量生成不溶于水的蓝色显色产物，待冷却至室温后，定量加入有机溶剂萃取显色产物，比色法测定吐温80含量。该方法适用于各种药物制剂中药用辅料吐温80的快速定量测定，但该方法耗时、重复性较差，且对蛋白浓度较高样品适用性差。
[0005]HPLC
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ELSD法结果较准确，应用范围较广，但是ELSD系统易受蛋白污染而影响检测结果；水解法是将Tween 80水解成油酸，利用高效液相色谱r/>‑
紫外检测器检测，该方法耗时较长，易受油酸稳定性的影响；质谱法需要使用昂贵的仪器，因此使用范围受限；HPLC
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FLD法由于将样品直接进样分析，蛋白质在吐温80出峰位置有干扰，因此检测准确度差。
[0006]此外，CN103940773A公开了一种快速测定血必净注射液中吐温
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80含量的方法。该方法包括如下步骤：(1)向血必净注射液中添加不同质量的吐温
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80，配制至少15种含有不同浓度吐温
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80的血必净注射液标准品；(2)采集所述血必净注射液标准品的近红外光谱图；(3)采用化学计量学方法，建立所述血必净注射液标准品中吐温
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80的含量与所述近红外光谱图之间的校正模型；(4)采集待测血必净注射液的近红外光谱图，并输入至所述校正模型中，即得到待测血必净注射液中吐温
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80的含量。该方法作为一种快速测定方法，亦可用于生产过程中血必净注射液关键生产工艺点的中间体的快速在线测定，为生产过程的质量控制提供一种实时在线快速的检测方法。该方法与质谱法同样需要昂贵的仪器，且同样无法排除蛋白质的干扰。
[0007]因此，提供一种准确有效的、能够检测单克隆抗体注射液中吐温80的含量且不受蛋白质干扰的检测方法，对于本领域而言具有重要的意义。

技术实现思路

[0008]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于固相萃取检测单克隆
抗体注射液中吐温80含量的方法。所述方法具有操作便捷，检测周期短，数据重现性好，结果准确度高等优点。
[0009]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]本专利技术提供一种基于固相萃取检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法，所述方法包括单克隆抗体注射液的预处理和流动注射高效液相色谱检测的步骤；
[0011]所述预处理的具体步骤如下：
[0012]将所述单克隆抗体注射液上样至平衡后的固相萃取柱，收集初始流出液，再使用淋洗液进行淋洗，收集后续流出液，而后将所得初始流出液与后续流出液混合，浓缩干燥后复溶，得到待测样品；
[0013]其中，所述固相萃取柱的填料为以Protein A为配基的亲和层析介质；所述淋洗液为40～100％的甲醇水溶液；
[0014]所述高效液相色谱检测使用的流动相包括：
[0015]氯化钠0.1～0.15M、十水四硼酸钠0.025～0.03M、乙腈3～5wt％、N
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苯基
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萘胺4～6M和吐温80 2～3mg/L。
[0016]本专利技术所述的单克隆抗体多为IgG类抗体，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4四种亚型，其Fc片段与Protein A具有良好的结合作用。本专利技术所使用的固相萃取柱中填有Protein A为配基的介质，单克隆抗体注射液经固相萃取预处理后，单克隆抗体结合在了固相萃取柱上，吐温80随淋洗液冲洗而流出，并收集，经干燥复溶后进行液相色谱检测，使得检测结果不受单克隆抗体的干扰。
[0017]本专利技术中，所述单克隆抗体注射液中蛋白的浓度为60～200mg/mL，例如可以是60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、120mg/mL、140mg/mL、150mg/mL、160mg/mL、180mg/mL或200mg/mL等；吐温80的含量为0.005～0.015wt％，例如可以是0.005wt％、0.006wt％、0.008wt％、0.01wt％、0.012wt％或0.015wt％等。
[0018]本专利技术所述方法尤其适用于蛋白含量较高、吐温浓度较低的单克隆抗体注射液，对于此类单克隆抗体，所述方法相比于常规的添加饱和氯化钠的乙醇溶液使蛋白质沉淀后检测吐温80的方法，其效果明显较好；且对于蛋白含量和吐温含量都较低的单克隆抗体注射液，本专利技术所述方法也同样适用，但是相比于蛋白含量较高、吐温浓度较低的注射液，其改善效果的提升度并不明显。
[0019]本专利技术中，对于淋洗液的要求较高，在样品的预处理过程中，超纯水、甲醇水溶液或乙醇水溶液均为可使用的淋洗液，但是以乙腈为淋洗液时，在吐温80出峰位置处有很大的干扰；同时相比于超纯水、乙醇水溶液等淋洗液，所述淋洗液为甲醇水溶液，尤其是使用体积分数为40～100％(例如可以是40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的甲醇水溶液处理样品时，所得高效液相色谱图中吐温80的峰较为明显，无杂质干扰，便于定量。
[0020]本专利技术中，流动相中含有适量的吐温80，能保证形成胶束以便定量，不会对样品中的吐温80的定量测定造成影响。但是，吐温80的添加量会影响吐温80含量极低的样品定量。
[0021]本专利技术提供的固相萃取
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流动注射HPLC荧光分析法检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法，一方面通过以Protein A为介质的固相萃取技术，消除了单克隆抗体对吐温80检测结果的干扰，另一方面，固相萃取与流动注射HPLC相结合，相比传统方法的操作更加
便捷，数据重现性较好，检测周期也更短，5小时内就可以出检测结果，且该方法仅特异性的针对吐温80，对于单克隆抗体注射液中的其他杂质无明显的检出和定量效果。
[0022]本专利技术中，所述流动注射HPLC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于固相萃取检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法，其特征在于，所述方法包括单克隆抗体注射液的预处理和流动注射高效液相色谱检测的步骤；所述预处理的具体步骤如下：将固相萃取柱的填料分散于超纯水中，所述超纯水与填料的体积比为(4～6):1，而后离心，去除所述超纯水；所述填料为以Protein A为配基的亲和层析介质作为填料；将所述单克隆抗体注射液上样至平衡后的固相萃取柱，收集初始流出液，再使用体积分数为100％的甲醇作为淋洗液进行淋洗，收集后续流出液，而后将所得初始流出液与后续流出液混合，浓缩、干燥后复溶，得到待测样品；其中，所述单克隆抗体为IgG抗体，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体，且所述单克隆抗体注射液中蛋白的浓度为60～200mg/mL，吐温80的含量为0.005～0.015wt％；；所述高效液相色谱检测使用的流动相包括：氯化钠0.1～0.15M、十水四硼酸钠0.025～0.03M、乙腈3～5wt％、N
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苯基
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萘胺4～6M和吐温80 2～3mg/L；所述浓缩采用的方法为真空离心浓缩，所述真空离心浓缩的转速为1000～1500rpm，温度为25～50℃，时间为3～4h。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中还包括清洗所述固相萃取柱的步骤；所述清洗使用的清洗液包括摩尔质量为20～50mM的醋酸水溶液。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的柱温为25～26℃；所述高效液相色谱检测的进样量为8～10μL。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的检测器为荧光检测器；所述荧光检测器的荧光最大激发波长为350nm；所述荧光检测器的荧光最大发射波长为420nm。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括配制标...

【专利技术属性】
技术研发人员：张博慧，贾戴辉，许俊彦，邵喆，黄应峰，
申请(专利权)人：宝船生物医药科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：