一种基于非靶向代谢组学检测GIST患者血浆中伊马替尼代谢物的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于非靶向代谢组学检测GIST患者血浆中伊马替尼代谢物的方法，采集若干名未服用及长期规律服用I M的GIST患者外周静脉血，进行处理后，采用UPLC

【技术实现步骤摘要】
一种基于非靶向代谢组学检测GIST患者血浆中伊马替尼代谢物的方法


[0001]本专利技术涉及生物医学领域，特别是涉及一种基于非靶向代谢组学检测GIST 患者血浆中伊马替尼代谢物的方法。

技术介绍

[0002]胃肠间质瘤(Gastrointestinal Stromal Tumors，GIST)是消化道最常见的间叶源性肿瘤，约占胃肠道肿瘤0.3％
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1％，且其发病率有年轻化趋势。甲磺酸伊马替尼(imatinib，IM)是一种酪氨酸酶(TKIs)抑制剂，具有良好的抑制c
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Kit活性的作用，其作为靶向药物应用于GIST的临床治疗，对于完全切除的中高危以及不可切除、复发转移或晚期的GIST患者，取得了令人瞩目的成就。经研究发现，IM作为口服小分子靶向药物，存在约75％的个体内差异及60％的个体间差异，且约80％的患者在治疗1
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3年后出现了继发性耐药。因此，筛选适合IM治疗的GIST患者以及预测IM治疗的疗效敏感性，是临床面临的挑战。
[0003]目前，应用于消化道肿瘤的血浆生物标志物包括癌CEA、AFP、CA199、CA125 及CA72
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4等。上述血浆标志物主要用于GIST的辅助筛查、诊断，但确诊为GIST 后，用于IM治疗的生物学标志物研究尚属于空白阶段。肿瘤内的癌细胞基因组具有不稳定性的特点，易发生新的突变，与此同时，代谢产物的变化更接近反应生物体的表型。因此，以血浆特异性代谢物作为IM治疗GIST的生物学标志物的研究，对筛选出适合IM治疗的GIST患者有着重大的社会效益。
[0004]代谢组学是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想，对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，是系统生物学的组成部分。非靶向代谢组学可无偏向地检测样本中所有能检测到的代谢物分子，能全面有效的反映出生物体的差异。其中，核磁共振波谱和质谱是用于表征代谢物最主要的手段，并且可与色谱联用以提高灵敏度和准确度。由于血浆代谢物的复杂性，传统的分析手段难以达到精确地分析结果。液相色谱
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质谱/质谱联用可克服背景干扰，提高信噪比，对复杂样品仍可达到很高的灵敏度。
[0005]因此，使用非靶向代谢组学研究出适用于IM治疗的生物学标志物的方法，可为消化道肿瘤确诊后的药物治疗有效性、针对性及无创筛选、标志物表征奠定基础。

技术实现思路

[0006]针对上述问题，本专利技术提供了一种基于非靶向代谢组学检测GIST患者血浆中伊马替尼代谢物的方法，以代谢产物反应生物体的表型，识别代谢过程中生物标志物，为适用于IM治疗的GISI患者的有效性治疗提供技术支撑，可为消化道肿瘤确诊后的药物治疗有效性、针对性及无创筛选、标志物表征奠定基础。
[0007]本专利技术的技术方案是：
[0008]1、一种基于非靶向代谢组学检测GIST患者血浆中伊马替尼代谢物的方法，包括以
下步骤：
[0009]S1、分别采集若干名未服用及长期规律服用IM的GIST患者的外周静脉血，并将采集的外周静脉血进行离心处理，然后低温保存，得到血浆样本；
[0010]S2、采用二维液相色谱法分析血浆样本中IM血药浓度，根据测出的血药浓度值，将所述的血浆样本分成至少两组；
[0011]S3、量取适量体积分组后的血浆样本分别转移到离心管中，加入大于离心管中血浆样本体积的甲醇进行涡旋，再进行低温孵育；将孵育后的样本涡旋后，离心收取上清液,静置；将静置后的上清液再次离心，转置进样瓶中，得到待测样本；
[0012]S4、对待测样本进行非靶向检测，得到血浆中的代谢物原始数据；
[0013]S5、对原始数据进行多变量分析，并以OPLS
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DA模型的变量投影重要度值，即VIP值结合t检验的P值以及差异倍数分析的FC值，并以VIP≥1,P<0.05， FC≥2或≤0.5的条件寻找差异代谢物，检索数据库以定性出GIST代谢标志物；
[0014]S6、对代谢标志物进行KEGG通路分析，确定GISI患者的代谢过程。
[0015]上述技术方案的工作原理如下：
[0016]IM是KIs抑制剂，其作为靶向药物应用于GIST的临床治疗，但服用IM的患者存在巨大的个体间差异，且由于肿瘤内的癌细胞基因组不稳定，易发生新的突变，目前尚未有技术手段筛选出适合采取IM治疗的GIST患者。而代谢产物的变化接近生物体的表型，通过对代谢物质的表征，得出的差异代谢物可以反映人体内的病理变化。本申请专利技术人采取UPLC
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QTOF/MS联用技术测试出不同患者的血液代谢物数据，通过血药浓度高低对患者进行分组，可以更清楚直观的了解血药浓度差异与代谢物表达量差异的关联，通过UPLC
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QTOF/MS联用技术测试，对于未知的物质，可得出碎片信息，通过检索数据库对代谢物结构进行结构鉴定。最后经过统计学分析，基于OPLS
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DA结果，从VIP值可以初步筛选出不同组间的差异代谢物，通常认为VIP≥1的代谢物为差异显著，同时结合单变量分析的t检验的P值和FC来进一步筛选得出GIST代谢标志物，设置代谢物的表达量在组间差异为2倍以上或0.5倍以下，即选取FC≥2或≤0.5的代谢物，认为t检验的P＜0.05是有意义的，筛选得到的差异代谢物也越可靠。可为适用于IM治疗的GISI患者的有效性治疗提供技术支撑，可为消化道肿瘤确诊后的药物治疗有效性、针对性及无创筛选、标志物表征奠定基础。
[0017]在进一步的技术方案中，步骤S1中，将所述外周静脉血收集于离心管中，在室温下5000r/min离心5min，收取上清液转置EP管中，并在
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80℃环境中保存，得到血浆样本。
[0018]设置转速为5000r/min，时间5min，在短时间即可彻底分离开小分子化合物。上清液收取完毕后立即转移至冰箱中
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80℃低温保存，可防止蛋白聚集，保存时间更久。
[0019]在进一步的技术方案中，步骤S2中根据测出的血药浓度值，将IM血药浓度＞2000ng/mL的设为A组、IM血药浓度1100
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2000ng/mL的设为B组、IM血药浓度＜1100ng/mL的设为C组和未服用IM的GIST患者设为D组。
[0020]通过将患者分组，可了解相同服药情况下，患者间血药浓度差异与代谢物表达量差异的关联，有利于直观分析并寻找生物标志物。
[0021]在进一步的技术方案中，步骤S3中所述甲醇含有1ppm的2
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氯苯丙氨酸，进行涡旋后于
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20℃下孵育0.5h；将孵育后的血浆样本，于4℃下12000r/min 离心处理10min，收取200uL上清液转置新的离心管中，于
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20℃下静置0.5h；将静置后的上清液于4℃下12000r/
min再次离心处理15min，取上清液转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于非靶向代谢组学检测GIST患者血浆中伊马替尼代谢物的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、分别采集若干名未服用及长期规律服用IM的GIST患者的外周静脉血，并将采集的外周静脉血进行离心处理，然后低温保存，得到血浆样本；S2、采用二维液相色谱法分析血浆样本中IM血药浓度，根据测出的血药浓度值，将所述的血浆样本分成至少两组；S3、量取适量体积分组后的血浆样本分别转移到离心管中，加入大于离心管中血浆样本体积的甲醇进行涡旋，再进行低温孵育；将孵育后的样本涡旋后，离心收取上清液,静置；将静置后的上清液再次离心，转置进样瓶中，得到待测样本；S4、对待测样本进行非靶向检测，得到血浆中的代谢物原始数据；S5、对原始数据进行多变量分析，并以OPLS
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DA模型的变量投影重要度值，即VIP值结合t检验的P值以及差异倍数分析的FC值，并以VIP≥1,P<0.05，FC≥2或≤0.5的条件寻找差异代谢物，检索数据库以定性出GIST代谢标志物；S6、对代谢标志物进行KEGG通路分析，确定GISI患者的代谢过程。2.根据权利要求1所述的一种基于非靶向代谢组学检测GIST患者血浆中伊马替尼代谢物的方法，其特征在于，步骤S1中，将所述外周静脉血收集于离心管中，在室温下5000r/min离心5min，收取上清液转置EP管中，并在
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80℃环境中保存，得到血浆样本。3.根据权利要求1所述的一种基于非靶向代谢组学检测GIST患者血浆中伊马替尼代谢物的方法，其特征在于，步骤S2中根据测出的血药浓度值，将IM血药浓度＞2000ng/mL的设为A组、IM血药浓度1100
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2000ng/mL的设为B组、IM血药浓度＜1100ng/mL的设为C组和未服用IM的GIST患者设为D组。4.根据权利要求1所述的一种基于非靶向代谢组学检测GIST患者血浆中伊马替尼代谢物的方法，其特征在于，步骤S3中所述甲醇含有1ppm的2
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氯苯丙氨酸，进行涡旋后于
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20℃下孵育0.5h；将孵育后的血浆样本，于4℃下12000r/min离心处理10min，收取200uL上清液转置新的离心管中，于
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20℃下静置0.5h；将...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈燕，肖洪涛，张蕊，黄婷文丽，王秋菊，徐蓓，
申请(专利权)人：四川省肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：