一种人源诱导肝向分化干细胞的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种人源诱导肝向分化干细胞的制备方法及其应用，所述方法包括将人源诱导多能干细胞(human induced pleuripotent stem cell,hiPSC)接种在matrigel包被的六孔细胞培养皿上，用mTeSR

【技术实现步骤摘要】
一种人源诱导肝向分化干细胞的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物制药
，具体涉及一种人源诱导肝向分化干细胞的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]各种原因导致的急慢性肝病目前仍然是影响人们健康的主要因素之一，包括各种病毒性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝炎和遗传性肝病等。随着近年来诊断技术水平和对疾病认识的提高，越来越多的自身免疫性肝炎和遗传性肝病等肝病也不再罕见。与此同时，随着人们生活水平的提高，酒精和糖的摄入量呈明显升高趋势，酒精性肝病/非酒精性肝病/脂肪肝已成为不可忽视的公共卫生健康问题。这些肝脏疾病长期迁延不愈可发展成肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。虽然近年来针对这些肝病的诊断与治疗手段有了很大的进步，但是对于终末期肝病
‑
肝硬化仍然缺乏有效的治疗手段，肝脏移植是目前临床上唯一的治疗手段，但是缺乏足够及合适的同种异体供体肝脏是晚期肝病患者需要移植时长期面临的问题。
[0003]细胞移植(cell transplantation)是近年来发展起来的热门技术，特别是干细胞(stem cell)移植由于干细胞来源广泛，可体外扩增和工业化生产等优点被寄予很大的希望，但是干细胞体外肝细胞定向分化(hepatic
‑
specified differentiation)仍然存在着分化周期长，费用较高，分化成熟度不够并且再生能力不强等缺点需要克服和解决。现在全世界的科学家们试图利用细胞移植技术来治疗和预防各种肝脏疾病，如何提供更好的肝向分化干细胞来用于细胞移植治疗各种肝病来满足临床的需要，是亟待要解决的技术问题。

技术实现思路

[0004]为此，本专利技术提供一种人源诱导肝向分化干细胞的制备方法及其应用。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]本专利技术提供一种人源诱导肝向分化干细胞的制备方法，所述方法包括将人iPS干细胞用mTeSR
TM
1干细胞培养液进行培养，待人iPS干细胞生长明显时，向所述mTeSR
TM
1干细胞培养液中加入激活素A处理，所述人iPS干细胞进行内胚层的诱导分化，得到内胚层细胞；
[0007]将所述内胚层细胞在含有骨形成蛋白4和成纤维细胞生长因子2的RPMI+B
27
培养基中培养，使得所述内胚层细胞定向分化，得到肝向分化干细胞。
[0008]本专利技术的一个实施例中，所述人iPS干细胞的培养环境为4％氧气，5％二氧化碳。
[0009]本专利技术的一个实施例中，所述内胚层诱导分化的环境条件为20％氧气，37℃，培养5天。
[0010]本专利技术的一个实施例中，所述内胚层细胞定向分化的条件为4％氧气，37℃，培养5天。
[0011]本专利技术的一个实施例中，所述骨形成蛋白4的浓度为20ng/mL。
[0012]本专利技术的一个实施例中，所述成纤维细胞生长因子2的浓度为10ng/mL。
[0013]上述所述方法制备的人源诱导肝向分化干细胞在治疗α
‑
1抗胰蛋白酶缺乏症和/
或其它肝病的药物制剂中的应用，也属于本专利技术的保护范围。
[0014]本专利技术具有如下优点：
[0015]试验证明：在本专利技术方法制备的人源诱导肝向分化干细胞，并通过脾髓注射法将其移植到小鼠的肝脏中再生，不会产生不必要的肝脏肿瘤，本专利技术中专利技术制备的肝向分化干细胞(hepatic
‑
specified stem cell)具有减少分化时间，减少费用，增强肝脏体内再生能力和成熟度等优点，该技术在临床应用具有广阔的前景。
[0016]本专利技术方法制备的人源诱导多能干细胞衍生的肝细胞样细胞可以是原代肝细胞的很有前途的替代品，其具有在体外增殖生产的优势，而且没有像胚胎干细胞那样的受到过多伦理道德的约束。
附图说明
[0017]为了更清楚地说明本专利技术的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
[0018]本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本专利技术可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本专利技术所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本专利技术所揭示的
技术实现思路
得能涵盖的范围内。
[0019]图1为本专利技术实施例提供的人源诱导肝向分化干细胞的制备流程图；
[0020]图2为本专利技术实施例提供的人源诱导肝向分化干细胞在转基因小鼠肝脏内的增生。移植细胞在转基因小鼠肝脏内的增生情况通过人血清白蛋白和α
‑
1抗胰蛋白酶的免疫荧光染色进行评估，刻条＝100μm。20
×
显微镜放大率；
[0021]图3为本专利技术实施例提供的小鼠血中人血清白蛋白含量(n＝6).所有值均以平均值+SEM表示.*P<0.05；
[0022]图4为本专利技术实施例提供转基因小鼠肝脏内人血清白蛋白基因DNA的含量百分比(n＝6).所有值均以平均值+SEM表示*P<0.05。
具体实施方式
[0023]以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0024]本专利技术中，人iPS干细胞(DYR0100)购买自美国ATCC，mTeSR
TM
1购自Stemcell,Vancouver,Canada。
[0025]实施例1、人源诱导肝向分化干细胞的制备方法
[0026]如图1所示，本实施例提供一种人诱导肝向分化干细胞的制备方法，其包括以下步骤：
[0027]步骤一、干细胞培养
[0028]细胞培养板的包被：用移液管吸取6ml基础培养基(DMEM/F
‑
12)于15ml falcon试管中，从冰箱中取出分装好的0.25ml matrigel(Corning,NY,USA)，将matrigel混匀在0.5ml基础培养液中，溶解后与剩余的基础培养液混合；在6孔板中每孔板加入1ml混合基础培养液，并旋转六孔板，使凝胶液均匀地覆盖在板上，放置在超净台1小时。吸去凝胶液，用DMEM/F
‑
12冲洗一次，得到包被的细胞培养板。
[0029]将1百万人源iPS干细胞加入到2ml mTeSR
TM
1培养液中，混匀。然后在matrigel包被的6孔细胞培养板中，进行培养，将细胞培养板置于4％氧气，5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人源诱导肝向分化干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将人iPS干细胞用mTeSR
TM
1干细胞培养液进行培养，待人iPS干细胞生长明显时，向所述mTeSR
TM
1干细胞培养液中加入激活素A处理，所述人iPS干细胞进行内胚层的诱导分化，得到内胚层细胞；将所述内胚层细胞在含有骨形成蛋白4和成纤维细胞生长因子2的RPMI+B
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培养基中培养，使得所述内胚层细胞定向分化，得到肝向分化干细胞。2.如权利要求1所述的人源诱导肝向分化干细胞的制备方法，其特征在于，所述人iPS干细胞的培养环境为4％氧气，5％二氧化碳。3.如权利要求1所述的人源诱导肝向...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁建强，
申请(专利权)人：丁建强，
类型：发明
国别省市：