一种KASP-SNP分子探针及其检测方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的KASP

【技术实现步骤摘要】
一种KASP
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SNP分子探针及其检测方法与应用


[0001]本专利技术属于三唑类杀菌剂抗药性检测
，具体涉及一种检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的KASP
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SNP分子探针及其检测方法与应用。

技术介绍

[0002]由条形柄锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起的条锈病是小麦上最重要的真菌病害，常年威胁小麦安全生产，病害大流行年份造成严重减产甚至绝收。化学防治是小麦条锈病应急防控的重要手段，三唑类杀菌剂(主要是三唑酮)用于中国小麦条锈病防治已愈四十年。单一药剂的长期使用已引致条形柄锈菌对该类杀菌剂的抗药性，然而由于条形柄锈菌为严格活体专性寄生真菌，迄今未有有效方法检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂的抗药性，导致田间过量用药并且达不到之前的防效，一方面增大防治成本，另一方面造成环境污染。

技术实现思路

[0003]本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的KASP
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SNP分子探针及其检测方法与应用，该KASP
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SNP分子探针用于小麦条形柄锈菌三唑类杀菌剂抗药性的快速检测。
[0004]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的KASP
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SNP分子探针，所述KASP
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SNP分子探针包括正向引物F1、正向引物F2和反向引物R；所述正向引物F1具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述正向引物F2具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述反向引物R具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
[0005]本专利技术还提供了上述的KASP
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SNP分子探针检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的方法，该方法为：
[0006]S1、提取小麦条形柄锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)夏孢子的基因组DNA，得到待检测基因组DNA；
[0007]S2、以S1中得到的待检测基因组DNA为模板，用KASP
‑
SNP分子探针对所述待检测基因组DNA进行PCR扩增得到PCR扩增产物，PCR扩增的反应体系为：浓度为25ng/μL的待检测基因组DNA 1.0μL、2
×
Taq MasterMix 10μL、10μM的正向引物F10.5μL、10μM的正向引物F20.5μL、10μM的反向引物R1μL、ddH2O补足至20μL；
[0008]PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸45s、每个循环延伸温度降低1℃，进行10次循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，进行20次循环；72℃终延伸10min，反应终止；
[0009]S3、待PCR板冷却至室温后，将S2中得到的PCR扩增产物，用酶标仪进行检测，然后将数据导入Kluster Caller软件进行基因分型，敏感性条形柄锈菌的碱基类型为AA，荧光显示为蓝色；抗药性条形柄锈菌的碱基类型为AT或者TT，其中AT为杂合抗药类型，荧光显示
为绿色，TT为纯合抗药类型，荧光显示为红色。
[0010]本专利技术还提供了上述的检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的KASP
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SNP分子探针的应用，其特征在于，所述KASP
‑
SNP分子探针用于快速检测小麦条形柄锈菌Puccinia striiformis f.sp.tritici对三唑类杀菌剂的抗药性。
[0011]优选地，所述三唑类杀菌剂为三唑酮。
[0012]本专利技术与现有技术相比具有以下优点：
[0013]本专利技术的KASP
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SNP分子探针用于小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的快速检测，能迅速将抗药性与敏感性条形柄锈菌菌系进行区分，具有准确、高效、灵敏、高通量等优势，可用于田间菌系快速抗药性检测，为开展大规模的小麦条形柄锈菌三唑类杀菌剂抗药性监测工作奠定基础，为条形柄锈菌化学防治、杀菌剂的合理使用提供理论依据。
[0014]下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步详细说明。
附图说明
[0015]图1是本专利技术的KASP
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SNP(单核苷酸多态性)基因分型示意图。
[0016]图2是本专利技术三唑酮不同浓度下条形柄锈菌敏感性菌株的表现图。
[0017]图3是本专利技术三唑酮不同浓度下条形柄锈菌抗药性菌株的表现图。
具体实施方式
[0018]实施例1
[0019]本实施例的检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的KASP
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SNP分子探针，所述KASP
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SNP分子探针包括正向引物F1、正向引物F2和反向引物R；所述正向引物F1具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述正向引物F2具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述反向引物R具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述三唑类杀菌剂为三唑酮；
[0020]本实施例还提供了上述的KASP
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SNP分子探针检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的方法，该方法为：
[0021]S1、提取小麦条形柄锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)夏孢子的基因组DNA，得到待检测基因组DNA；
[0022]S2、以S1中得到的待检测基因组DNA为模板，用KASP
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SNP分子探针对所述待检测基因组DNA进行PCR扩增得到PCR扩增产物，PCR扩增的反应体系为：浓度为25ng/μL的待检测基因组DNA 1.0μL、2
×
Taq MasterMix 10μL、10μM的正向引物F10.5μL、10μM的正向引物F20.5μL、10μM的反向引物R1μL、ddH2O补足至20μL；
[0023]PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸45s、每个循环延伸温度降低1℃，进行10次循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，进行20次循环；72℃终延伸10min，反应终止；
[0024]S3、待PCR板冷却至室温后，将S2中得到的PCR扩增产物，用LUOstar Omega多功能酶标仪进行检测，然后将数据导入Kluster Caller软件进行基因分型，敏感性条形柄锈菌的碱基类型为AA，荧光显示为蓝色；抗药性条形柄锈菌的碱基类型为AT或者TT，其中AT为杂合抗药类型，荧光显示为绿色，TT为纯合抗药类型，荧光显示为红色。
[0025]如图1所示，Kluster Caller软件测试的KASP
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SNP(单核苷酸多态性)基因分型示<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的KASP
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SNP分子探针，其特征在于，所述KASP
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SNP分子探针包括正向引物F1、正向引物F2和反向引物R；所述正向引物F1具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述正向引物F2具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述反向引物R具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。2.一种如权利要求1所述的KASP
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SNP分子探针检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的方法，其特征在于，该方法为：S1、提取小麦条形柄锈菌Puccinia striiformis f.sp.tritici夏孢子的基因组DNA，得到待检测基因组DNA；S2、以S1中得到的待检测基因组DNA为模板，用KASP
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SNP分子探针对所述待检测基因组DNA进行PCR扩增得到PCR扩增产物，PCR扩增的反应体系为：浓度为25ng/μL的待检测基因组DNA 1.0μL、2
×
Taq MasterMix 10μL、10μM的正向引物F1 0.5μL、10μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹刚明，纪凡，赵鋆，周爱红，夏铭浩，刘悦，康振生，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：