还原酶LX05基因，含有该基因的基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种还原酶LX05基因，含有该基因的工程菌及其应用。所述还原酶LX05基因的核苷酸序列为SEQID NO.1；所述还原酶LX05基因所编码的还原酶蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。将还原酶LX05基因构建重组质粒再导入E.coliBL21(DE3)即获得含有该基因的基因工程菌。所述还原酶LX05基因编码的还原酶蛋白质或含有该还原酶基因的基因工程菌在合成手性化合物(优选(R)

【技术实现步骤摘要】
还原酶LX05基因，含有该基因的基因工程菌及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程，具体涉及还原酶LX05基因，含有该基因的基因工程菌及其应用。

技术介绍

[0002]手性化合物是一类重要的手性模块化合物，广泛应用于医药、化工和农业等领域。利用还原酶或其全细胞不对称还原潜手性羰基化合物是制备光学活性手性化合物的有效途径。还原酶是一类以NAD(P)H为辅酶、在酶学分类上属于短链脱氢酶/还原酶类的氧化还原酶，因其具有高化学选择性、高区域选择性和立体选择性，被认为是一类极具潜力的用于不对称催化还原反应的生物催化剂。然而，大多数已知的还原酶在催化制备手性化合物时存在催化活性较低、反应效率低下、底物初始浓度不高、热稳定性差、适用底物种类有限、有机溶剂耐受性差、水相溶解度低等问题，这些问题的存在严重制约着当前生物催化在工业上广泛应用，这些存在的问题可以通过选择高效、合适的还原酶催化剂来克服。因此，寻找具有优良特性的新型还原酶催化剂已成为必要，而且开发出新型、高效的还原酶催化剂还可以丰富微生物还原酶库，为生物催化制备功能手性化合物提供新酶源，为手性药物中间体的制备提供高效、绿色的生物催化剂。
[0003](R)
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[3,5
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二(三氟甲基)苯基]乙醇是合成用于治疗癌症病人化疗时减少呕吐和延迟性呕吐的药物阿瑞吡坦和NK
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1受体拮抗剂的重要手性中间体。制备(R)
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[3,5
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二(三氟甲基)苯基] 乙醇的方法有化学法合成、酶法拆分和生物催化的不对称还原等，基于还原酶或其全细胞为生物催化剂的不对称还原法具有立体选择性高、反应条件温和，副产物少和产率高等优点，越来越备受研究者关注。近年来，一些具有不对称还原制备(R)
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[3,5
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二(三氟甲基)苯基] 乙醇的还原酶或含还原酶的微生物细胞已被报道，如Leifsonia xyli，Lactobacillus kefir、 Penicillium expansum、Microbacterium oxydans、Trichoderma asperellum ZJPH0801、 Chryseobacterium sp.CA49、Burkholderia cenocepacia和固定化的酮还原酶等。然而，这些还原酶或微生物在催化过程中大多数的底物浓度不高、产物浓度低和反应时间较长，不适合用于工业化生产(R)
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[3,5
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二(三氟甲基)苯基]乙醇。

技术实现思路

[0004]针对已报道大多数还原酶催化制备手性化合物(如(R)
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二(三氟甲基)苯基]乙醇)时存在催化活性偏低、底物耐受性差、底物初始浓度低、产物浓度不够高，以及需要额外添加昂贵辅酶、反应时间长等问题，本专利技术提供一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好、反应时间短、无需额外添加辅酶的还原酶LX05基因，含有还原酶LX05基因的基因工程菌，以及还原酶LX05基因编码的还原酶蛋白质，或含有还原酶LX05基因的基因工程菌在催化还原制备手性化合物中的应用。特别地，将该酶用于(R)
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[3,5
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二(三氟甲基)苯基]乙醇的制备中，不仅催化活性高、底物耐受性好、产物浓度高、催化反应时间短，而且实现了高浓度(768g/L) 底物的转化。
[0005]本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：
[0006]一种还原酶LX05基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，所述还原酶LX05基因全长(从起始密码子到终止密码子)为756bp，G+C含量为70.94％，编码251个氨基酸，所述氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。
[0007]所述的还原酶LX05基因核苷酸序列所编码的还原酶蛋白质，所述还原酶蛋白质的氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。
[0008]SEQID NO.1：
[0009]ATGGCCACCTACGACGTGACGGACCGCTCGGCGATCGTGACCGGAGCGGGCTCAGGC ATCGGACGGGCGATCGCCGCCACGCTCGCCGAGAACGGCGCGGCCGTCCTGGTCGCA GACCTCGACGAAGAAGCCGCCAACGTCGTCGTCAAGGAGATCGTCGCGGCCGGGGG CACGGCCGAGGCCTTCGTGGGCGACGTCGCCGACCCCGAGGTCGCGGAAGCCGCGGT GGCCGCCGCTGTGGAGCTCGCCCCGCTGCGCATCGCCGTCAACAACGCCGGCATCGG CGGTGCCGCCGCACCGGTCGGCGAGTACCCGATCGACAGCTGGCGCAAGGTCATCGA CGTCAACCTCAACGCCGTCTTCTACGGCATGCGGGCGCAGATCGACGCGATCGCCGGC AACGGCGGCGGCGCGATCGTCAACATGGCCTCGATCCTCGGCTCGGTGGGCATCGCCG GCTACTCGGCGTACGTCACCTCCAAGCACGCCCTGCTCGGCCTCACCAAGAACGCCG CCCTCGAGTACGCGGCGAAGAACGTTCGCGTCACCGCGGTCGGCCCCGGCTTCATCTC CACGCCGCTTCTCGAGTCCAACCTCGACGCCGATACGCAGCAGGCCCTGGCCGACAA GCACGCCGCCGGCCGCCTCGGCACCCCGGAGGAGGTCGCCGCGCTGGTCGCGTTCCT CGCCTCCGACGCCGCGAGCTTCATCACCGGCAGCTACCACCTCGTCGACGGCGGCTAC ACCGCCCAGTAA
[0010]SEQ ID NO.2：
[0011]MATYDVTDRSAIVTGAGSGIGRAIAATLAENGAAVLVADLDEEAANVVVKEIVAAGGTAE AFVGDVADPEVAEAAVAAAVELAPLRIAVNNAGIGGAAAPVGEYPIDSWRKVIDVNLNAV FYGMRAQIDAIAGNGGGAIVNMASILGSVGIAGYSAYVTSKHALLGLTKNAALEYAAKN VRVTAVGPGFISTPLLESNLDADTQQALADKHAAGRLGTPEEVAALVAFLASDAASFITGS YHLVDGGYTAQ
[0012]含有所述的还原酶LX05基因的基因工程菌，优选重组表达载体pET
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28a(+)；优选与载体连接的酶切位点为NcoⅠ和HindⅢ；优选重组表达菌株的宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。
[0013]所述的基因工程菌E.coli BL21(DE3)的构建方法：含有所述的还原酶LX05基因的 pET
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28a(+)重组质粒转化到表达宿主菌E.coli B本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种还原酶LX05基因，其特征在于，所述还原酶LX05基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，所述基因全长为756bp，G+C含量为70.94％，编码251个氨基酸，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。2.权利要求1所述的还原酶LX05基因所编码的还原酶蛋白质，其特征在于，所述还原酶蛋白质的氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。3.一种含有权利要求1所述的还原酶LX05基因的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为基因工程菌E.coli BL21(DE3)
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LX05，所述基因工程菌的重组表达载体为pET
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28a(+)，与载体连接的酶切位点为NcoⅠ和HindⅢ，重组表达菌株的宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌E.coli BL21(DE3)的构建方法为：含有权利要求1所述的还原酶LX05基因的pET
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28a(+)重组质粒转化到表达宿主菌E.coliBL21(DE3)获得重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)，再将所获得的重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)转接到含50μg/mL卡那霉素的平板，37℃培养16h后，挑取单菌落转化子，经测序验证基因序列无误后，保存。5.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌E.coli BL21(DE3)
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LX05，按如下方法培养获得：取一定量的基因工程菌E.coli BL21(DE3)
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LX05加入到装有50mL L
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B培养基的250mL摇瓶中，37℃、150
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250rpm，培养8
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12h；然后取1mL培养液转接至装有100mL新鲜L
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【专利技术属性】
技术研发人员：王能强，
申请(专利权)人：湖南科技大学，
类型：发明
国别省市：