一种醛肟脱水酶及其在催化合成芳香腈类化合物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种醛肟脱水酶及其在催化合成芳香腈类化合物中的应用，属于生物催化研究领域。本发明专利技术将来源于恶臭假单胞菌Pseudomonas putida F1的醛肟脱水酶基因插入到表达载体中，构建重组表达质粒；再将其导入宿主细胞构建基因工程菌，可实现醛肟脱水酶的高效共表达。通过上述工程菌的催化作用，可实现从醛肟化合物到芳香腈高效生产的目的。该醛肟脱水酶表现出良好的催化稳定性、高催化活力等优点，有望成为生物法制备芳香腈的良好工业催化剂，促进腈化合物合成工艺的升级。促进腈化合物合成工艺的升级。促进腈化合物合成工艺的升级。

【技术实现步骤摘要】
一种醛肟脱水酶及其在催化合成芳香腈类化合物中的应用


[0001]本专利技术涉及生物催化研究领域，具体涉及一种醛肟脱水酶基因工程菌及利用该菌在水相中无氰源催化合成芳香族腈化合物的方法。

技术介绍

[0002]有机腈(R
‑
C≡N)是一类重要的化工原料和中间体，在医药合成和高分子聚合等产业中被广泛地应用。例如，己二腈是制备尼龙66的原料，丙烯腈是生产聚丙烯酰胺和丁腈橡胶的原料，3
‑
氰基吡啶是合成烟酰胺的中间体等。随着药物化学研究的深入研究，将氰基基团引入到小分子药物中是药物化学结构改造的重要策略之一。据统计，DrugBank数据库收录了50余种含氰基的小分子药物，尤其是芳香腈化合物，包括药物依他普伦、维拉帕米和利匹韦林等。迄今为止，化学家根据腈的结构和用途，已经开发出了多种腈化合物的合成方法，主要包括：烯烃的氢氰化法、烯烃的氨氧化法、卤代烃氰基取代法和酰胺脱水法。然而，这些化学合成方法都存在严重的弊端，如：需要使用剧毒化合物氰化氢或金属氰化物；高温、高压等苛刻条件；制备成本较高；产物的选择性较差；副产物较多等等问题。为避免上述缺点，醛肟脱水酶(aldoxime dehydratases,Oxds)催化醛肟脱水合成腈类化合物，是一种反应条件温和、环境友好的合成方法。
[0003]与化学法合成腈类化合物相比，生物催化具有明显的优势：(1)无氰源，避免使用剧毒化合物金属氰化物和氢氰酸；(2)底物为醛肟化合物，通过醛和羟胺制备得到，合成方法简单高效；(3)以水作为溶剂，在室温下反应，无需高毒性的金属催化剂，对环境相对友好。然而，醛肟脱水酶基因资源相对匮乏，目前仅报道了大约6种，如来源于绿假单胞菌B23(Pseudomonas chlororaphis B23)，禾谷镰刀菌MAFF305135(Fusarium graminearum MAFF305135)，红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)，球形红球菌A
‑
4(Rhodococcus globerulus A
‑
4)和假单胞菌K
‑
9(Pseudomonas sp.K
‑
9)等微生物。这些醛肟脱水酶普遍对芳香族底物活力较低，而且稳定性较差。
[0004]目前，针对醛肟脱水酶的研究主要集中在日本和德国研究者。Asano Y.教授(FEMS Microbiology Letters,158,1998,185
‑
190)等报道了来源于Bacillus sp.的醛肟脱水酶OxB
‑
1，在水相反应体系中，8.0mg/ml催化剂，1.5h内催化5mmol/L苯乙醛肟生成苯乙腈，转化率为100％。然而，醛肟脱水酶OxB
‑
1对3
‑
吡啶醛肟和苯甲醛肟等底物不具有催化活力。H.教授(Angewandte Chemie International Edition,2017,56,12361
‑
12366)等考察了五种醛肟脱水酶OxdA、OxdB、OxdFG、OxdRE和OxdRG催化合成芳香腈，底物浓度为5mmol/L，最高转化率仅为78％，大部转化率在7～30％之间。
[0005]国内针对醛肟脱水酶的研究鲜有报道。因此，开发一种新型的对芳香族底物具有高催化活力的醛肟脱水酶将具有很高的科学研究价值和应用潜力。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种对芳香族底物具有高催化活力的醛肟脱水酶，将其应
用于催化芳香族醛肟化合物脱水生成高附加值芳香腈类化合物。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]本专利技术采用基因探矿策略从GenBank数据库中筛选来源于恶臭假单胞菌Pseudomonas putida F1的醛肟脱水酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并构建重组表达质粒。该基因可在大肠杆菌中高效表达，表达的醛肟脱水酶OxdF1具有较高的催化芳香族醛肟化合物脱水合成芳香腈的活力。
[0009]具体的，所述醛肟脱水酶催化醛肟化合物脱水，合成芳香族腈类化合物，其反应式为：
[0010][0011]如上述反应式，在反应过程中，苯甲醛肟、2
‑
溴苯甲醛肟、3
‑
吡啶醛肟、2
‑
吡啶醛肟、噻吩
‑2‑
甲醛肟或2
‑
氯
‑6‑
氟苯甲醛肟在醛肟脱水酶的催化作用下，高效脱水合成相应的腈化合物。
[0012]因此，本专利技术提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的醛肟脱水酶在催化合成芳香腈类化合物中的应用。
[0013]优选的，催化的底物为苯甲醛肟、2
‑
溴苯甲醛肟、噻吩
‑2‑
甲醛肟、2
‑
氯
‑6‑
氟苯甲醛肟、3
‑
吡啶醛肟或2
‑
吡啶醛肟。
[0014]进一步的，本专利技术提供了一种基因重组工程菌在催化合成芳香腈类化合物中的应用，所述基因重组工程菌以大肠杆菌为宿主菌，所述宿主菌内含有包含了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的醛肟脱水酶编码基因的重组表达质粒。
[0015]所述基因重组工程菌的构建步骤为：通过基因克隆，获得醛肟脱水酶基因序列，将该序列连接到质粒载体上，获得重组表达质粒。将重组表达质粒转化到宿主细胞大肠杆菌中，获得基因重组工程菌。
[0016]优选的，所述重组表达质粒的原始载体为质粒载体pRSFDuet
‑
1。具体地，醛肟脱水酶编码基因位于质粒载体pRSFDuet
‑
1的多克隆位点BamH I和Not I之间。
[0017]优选的，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
[0018]研究表明，所述基因重组工程菌经自动诱导培养基诱导，能够高效表达醛肟脱水酶，该醛肟脱水酶表现出良好的催化稳定性、高催化活力。
[0019]具体的，所述应用包括以下步骤：以所述基因重组工程菌经发酵培养获得的菌体为催化剂，以醛肟化合物为底物，以pH为5.0～8.0的磷酸盐缓冲液为反应介质，25～40℃，100～300rpm条件下进行反应，分离纯化后获得相应的腈类化合物。
[0020]所述基因重组工程菌发酵培养的方法包括：将所述基因重组工程菌接种于含抗生素的自动诱导培养基中，培养至OD
600
值达到0.6～0.8，然后培养温度调至18～25℃，200rpm条件下继续培养10～12h，离心，收集菌体。
[0021]用磷酸盐缓冲液重悬基因工程菌细胞，获得静息细胞悬液；往静息细胞悬液中添
加醛肟化合物进行反应，反应完成后，从反应液中分离得到芳香腈。
[0022]优选的，底物为苯甲醛肟、2
‑
溴苯甲醛肟、噻吩
‑2‑
甲醛肟、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的醛肟脱水酶在催化合成芳香腈类化合物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述醛肟脱水酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，催化的底物为苯甲醛肟、2
‑
溴苯甲醛肟、噻吩
‑2‑
甲醛肟、2
‑
氯
‑6‑
氟苯甲醛肟、3
‑
吡啶醛肟或2
‑
吡啶醛肟。4.一种基因重组工程菌在催化合成芳香腈类化合物中的应用，其特征在于，所述基因重组工程菌以大肠杆菌为宿主菌，所述宿主菌内含有包含了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的醛肟脱水酶编码基因的重组表达质粒。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述重组表达质粒的原始载体为质粒载体pRSFDuet
‑
1。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，醛肟脱水酶编码基因位于质粒载体pRSFDuet
‑
1的多克隆位点BamH I和NotI之间。7.如权利要求4所述的应用，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴晓林，陈芝吉，郑浩腾，肖勤洁，毛斐滢，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：