一种利用花椒内生蜡样芽孢杆菌制备吡咯-2-羧酸的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种利用花椒内生蜡样芽孢杆菌制备吡咯

【技术实现步骤摘要】
一种利用花椒内生蜡样芽孢杆菌制备吡咯
‑2‑
羧酸的方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种利用花椒内生蜡样芽孢杆菌制备吡咯
‑2‑
羧酸的方法及应用。

技术介绍

[0002]花椒是一种重要的香辛料和药用经济作物，其化学成分主要有挥发油、生物碱、黄酮及酚类物质、酰胺类物质等，具有抗氧化、抗炎、镇痛等多种生物活性。植物内生菌是定殖于植物细胞间隙或细胞内，与宿主植物建立和谐共处关系的一类微生物。内生菌在适应特殊生存环境的过程中，形成特异的代谢及防御系统，能产生结构众多、生物活性多样的天然次级代谢产物。从花椒内生菌中寻找开发新的天然活性化合物具有重要科学意义和应用价值。
[0003]传统的吡咯
‑2‑
羧酸是采用酸、碱或酶对含蛋白质的原料进行水解,但是操作不方便，产物纯度低，产物产率少。因此，需要一种利用花椒内生蜡样芽孢杆菌制备吡咯
‑2‑
羧酸的方法及应用。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供一种操作简单、高效、化合物损失小的一种利用花椒内生蜡样芽孢杆菌制备吡咯
‑2‑
羧酸的方法及应用。
[0005]本专利技术包括以下步骤：
[0006](1)菌株活化：对花椒内生蜡样芽孢杆菌株进行37℃恒温培养活化；
[0007](2)菌株发酵：将所述花椒内生蜡样芽孢杆菌株接种至液体培养基，置于水浴恒温振荡培养时间为36～72h，得到发酵液；
[0008](3)对所述发酵液进行高速离心机处理后收集上清液，所述高速离心机处理发酵液的转速为8000～15000r/min，离心时间为5～ 10min，减压浓缩，冷冻干燥得次级代谢产物粗样；
[0009](4)次级代谢产物分离纯化：将所述次级代谢产物粗样进行层析柱分离后进行用高效液相色谱分离纯化，得到次级代谢产物吡咯
ꢀ‑2‑
羧酸。
[0010]进一步地，所述恒温培养活化的时间为24～72h。
[0011]进一步地，所述菌株发酵步骤中，所述液体培养基碳源和氮源分别为甘油和蛋白胨；甘油的浓度为0.3％～1.0％；蛋白胨的浓度为 0.5％～2.0％；培养基的初始pH为6.5～7.2。
[0012]进一步地，所述层析柱为大孔吸附树脂HP
‑
20层析柱，所述大孔吸附树脂HP
‑
20层析柱分离条件为：超纯水洗脱剂体积为800～1000 mL；次级代谢产物粗样与HP
‑
20填料质量比为1：20～1：25；次级代谢产物粗样的上样量为柱体积的15％～20％；超纯水等度洗脱的流速为2.0～3.0mL/min。
[0013]进一步地，所述高效液相色谱制备操作条件为：流速，0.5～1.2 mL/min；柱温，25～30℃；检测波长，254nm。
[0014]进一步地，所述次级代谢产物吡咯
‑2‑
羧酸的分子结构式为:
[0015][0016]一种利用花椒内生蜡样芽孢杆菌制备吡咯
‑2‑
羧酸的在抑制食源性致病菌中的应用。
[0017]本专利技术的有益效果为：
[0018]本专利技术提供的利用花椒内生蜡样芽孢杆菌制备吡咯
‑2‑
羧酸的方法步骤简单，操作方便，产物纯度高，产物产率高，易于大规模生产，此外，本专利技术制备得到的吡咯
‑2‑
羧酸对多种食源性致病菌均具有良好的抑制作用，可应用于抗菌剂制备领域。
附图说明
[0019]图1为吡咯
‑2‑
羧酸的电喷雾电离质谱图(ESI
‑
MS)；
[0020]图2为吡咯
‑2‑
羧酸的氢谱图(1H
‑
NMR)；
[0021]图3为吡咯
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羧酸的碳谱图(
13
C
‑
NMR)。
具体实施方式
[0022]以下对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。
[0023]以下结合实施例对本专利技术的特征及性能作进一步地详细描述。
[0024]本技术方案中采用的生物菌种材料样品花椒内生蜡样芽孢杆菌属Bacillus cereus ZBE的保藏地址在中国典型培养物保藏中心,中国武汉大学，保藏日期2021年5月27日，保藏编号CCTCC NO:M 2021566。实施例1
[0025](1)取
‑
80℃超低温冰箱保藏的花椒内生蜡样芽孢杆菌的甘油冻存管，置于超净工作台，取适量菌悬液，用基础肉汤培养基进行适量稀释，再用微量移液器吸取100μL稀释后的菌悬液涂布在基础琼脂培养基平板上，平板置于37℃电热恒温培养箱中培养活化24h，备用。
[0026](2)在超净工作台内，用灼烧灭菌后的接种环，从菌种活化平板上挑选蜡样芽孢杆菌单菌落，接种至优化后的液体培养基，培养基的碳源、氮源分别为0.5％甘油和1.5％蛋白胨，培养基的初始pH为 6.8。再将培养基置于37.2℃水浴恒温振荡器，120r/min振荡培养 48h，得到发酵液。用高速离心机，将发酵液在常温条件下8000r/min，离心5min，收集上清液，用旋转蒸发器减压浓缩，再冷冻干燥得次级代谢产物粗样，4℃存放备用。
[0027](3)将次级代谢产物粗样，按质量比为1：20上样至大孔吸附树脂HP
‑
20层析柱，上样量为柱体积的15％。用800mL超纯水等度洗脱，洗脱液流速为3.0mL/min；收集洗脱液，得到F1、F2、F3、 F4共4个组分，以金黄色葡萄球菌ATCC 6538为受试菌，检测各组分对受试菌
的抑菌活性，确定组分F2有抑菌活性，将组分F2过0.22 μm聚醚砜滤膜后，用高效液相色谱仪分离、纯化、制备得到11.22min 的色谱峰，得到次级代谢产物吡咯
‑2‑
羧酸，其中，制备型高效液相色谱仪选用ODS
‑
3色谱柱(20
×
250nm)；制备型高效液相色谱操作条件为：流速，1.0mL/min；柱温，25℃；检测波长，254nm；分析型高效液相色谱选用ODS
‑
3色谱柱(4.6
×
250nm)；分析型高效液相色谱操作条件为：流速，1.0mL/min；柱温，25℃；检测波长，254 nm，吡咯
‑2‑
羧酸的纯度达98％以上，产量为149.33mg/L。
[0028]实施例2
[0029](1)取
‑
80℃超低温冰箱保藏的花椒内生蜡样芽孢杆菌的甘油冻存管，置于超净工作台，取适量菌悬液，用基础肉汤培养基进行适量稀释，再用微量移液器吸取100μL稀释后的菌悬液涂布在基础琼脂培养基平板上，平板置于37℃电热恒温培养箱中培养活化24h，备用。
[0030](2)在超净工作台内，用灼烧灭菌后的接种环，从菌种本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用花椒内生蜡样芽孢杆菌制备吡咯
‑2‑
羧酸的方法及应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)菌株活化：对花椒内生蜡样芽孢杆菌株进行37℃恒温培养活化；(2)菌株发酵：将所述花椒内生蜡样芽孢杆菌株接种至液体培养基，置于水浴恒温振荡培养时间为36～72h，得到发酵液；(3)对所述发酵液进行高速离心机处理后收集上清液，所述高速离心机处理发酵液的转速为8000～15000r/min，离心时间为5～10min，减压浓缩，冷冻干燥得次级代谢产物粗样；(4)次级代谢产物分离纯化：将所述次级代谢产物粗样进行层析柱分离后进行用高效液相色谱分离纯化，得到次级代谢产物吡咯
‑2‑
羧酸。2.根据权利要求1所述一种利用花椒内生蜡样芽孢杆菌制备吡咯
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羧酸的方法及应用，其特征在于，所述恒温培养活化的时间为24～72h。3.根据权利要求1所述一种利用花椒内生蜡样芽孢杆菌制备吡咯
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羧酸的方法及应用，其特征在于，所述菌株发酵步骤中，所述液体培养基碳源和氮源分别为甘油和蛋白胨；甘油的浓度为0.3％～1.0％；蛋白胨的浓度为0.5％～2.0％；培养基的初始pH...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴艳萍，岳雨曦，陈冲，李霄洁，许树荣，钟凯，高鸿，山口五十磨，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：