一种曼氏无针乌贼神经肽的用途制造技术

本发明专利技术公开了一种曼氏无针乌贼神经肽的用途，该曼氏无针乌贼神经肽GnRH的基因cDNA全序列长432bp，开放阅读框273bp，编码90个氨基酸，5

【技术实现步骤摘要】
一种曼氏无针乌贼神经肽的用途
[0001]本申请是申请日为2018年1月25日，申请号为201810075238.9，专利技术名称为“一种曼氏无针乌贼神经肽及其用途”的中国专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及神经肽
，尤其是涉及一种曼氏无针乌贼神经肽的用途。
技术背景
[0003]曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)属软体动物(Mollusca)、头足纲(Cephalopoda)、十腕目(Decapoda)、乌贼科(Sepiidae)、无针乌贼属(Sepiella)。曼氏无针乌贼是一年生的中型乌贼，俗名叫墨鱼，生长快，肉质鲜美，是受市场欢迎的海味食品。头足纲，乌贼科。胴部盾形。胴长为胴宽的2倍。胴背具许多近椭圆形的白花斑。肉鳍前狭后宽，位于胴部两侧全缘，仅在末端分离。无柄腕长度一般为4＞3＞1＞2，吸盘4行。雄性左侧第四腕茎化。触腕穗狭柄形，吸盘约20行，小而密。内科椭圆形。记录最大胴长0.19m，最大体重0.7kg。分布在西北太平洋和北印度洋沿岸海域。主要作业渔场在中国浙江和福建沿岸海域。最高年产量超过8万吨，是世界重要经济种。主要为鲜食作为一种具有较高药用、食用价值的经济头足类，自20世纪80年代以来自然种群数量急剧下降，众多学者对于其资源保护以及生殖发育进行了研究。
[0004]神经肽是一类在生物体内主要分布在神经组织对机体有神经激素样作用或者神经元信息传递作用的生物活性多肽，它在串通整个神经系统和身体其他系统的功能方面起到重要作用，诸如生长发育，呼吸调控，体温调节等方面。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种曼氏无针乌贼神经肽以及该曼氏无针乌贼神经肽在鱼类养殖过程中利用神经肽及其拮抗剂进行生殖调控的用途，运用分子生物学手段分析了曼氏无针乌贼神经肽的基因序列、基因的组织表达特异性，并对其mRNA在乌贼脑组织中的特异表达位点进行了细胞定位，以及对整个乌贼生殖调控机理，为曼氏无针乌贼的种质资源保护和人工繁育提供一定的理论基础。
[0006]本专利技术为实现上述目的所采取的技术方案为：
[0007]提供一种曼氏无针乌贼神经肽的用途，在水产养殖过程中，GnRH类似物LHRH
‑
A或sGnRH
‑
A和多巴胺拮抗物DOM能够作为催产剂诱导鱼类进行人工繁育，在曼氏无针乌贼人工繁育过程中，利用神经肽及其拮抗剂可以较为有效地进行生殖调控；
[0008]上述曼氏无针乌贼神经肽的基因cDNA全序列长432bp，开放阅读框(ORF)273bp，编码90个氨基酸，5
′‑
UTR 86bp，3
′‑
UTR 73bp；ORF包括一段长31个氨基酸的信号肽和44个氨基酸的辅助序列，以及12个氨基酸的成熟肽：pQNYHFSNGWHPG；前体蛋白MW为10.1kDa，等电点pI为7.73；曼氏无针乌贼神经痛GnRH可参与调控曼氏无针乌贼生殖活动。
[0009]曼氏无针乌贼神经肽的基因cDNA全序列为：ACTTCCTTTACACTCGTCCCTCGCCTAAGAC
AAAAGAACACTTCAAATCTCCATCATCAGCTAAACATCTACCAGACAGTGACATCATGTCAACCTCCACAGCCTCGTCCAGCCTGAGAAGAATCCAATTTTTCACCTGTGCTATTCTTCCCCTCTCTTTCTGCATGCATATCCAGGCACAGAATTACCATTTTAGCAATGGATGGCACCCCGGTGGTAAACGAAGTGGACTTCCAGACATGCAGTGTCATTTCAGACCACAAACAAAAGCTACAATCGAGAAACTCTTAGACGAGGAAATCACACGTATAATTACTACATGTACCAATACAGTCAATGACATCGCAGACTTGCAGTAATTTTTCACAGGTCAAGCAAATTCACTGGATATACAACTACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
[0010]曼氏无针乌贼神经肽GnRH可参与调控曼氏无针乌贼生殖活动的分子生物学分析步骤包括：神经肽基因克隆和序列分析、神经肽组织特异性表达分析、神经肽脑组织表达定位分析，具体包括以下步骤：
[0011]神经肽基因克隆和序列分析操作为：
[0012]选取成熟健康的曼氏无针乌贼，用Trizol试剂从曼氏无针乌贼的脑组织中提取总RNA，提取的总RNA经测定其吸光度R值介于1.8
‑
2.0之间，则说明总RNA为有效；取3μL的RNA液将其点样到1％的琼脂糖凝胶上，在200V、150mA的电泳仪下跑胶15
‑
16分钟，取出胶在UVP紫外凝胶成像仪中分析RNA条带情况，能够看到一条清晰的28S、18S且比例为1.9
‑
2.1:1；使用反转录试剂盒，利用曼氏无针乌贼脑组织提取的总RNA合成cDNA第一条链；以曼氏无针乌贼脑组织cDNA作为模板，简并引物GnRH
‑
F和GnRH
‑
R进行进行GnRH基因核心片段的PCR扩增，用1％琼脂糖电泳检测PCR产物，找到符合预期大小的条带，用凝胶回收试剂盒进行割胶回收纯化，对纯化后的目标片段进行克隆连接；分别以曼氏无针乌贼脑组织总RNA为模板，获得扩增3
′
RACE片段、5
′
RACE片段所需的模板cDNA后，利用巢式PCR来扩增3
′
RACE未知片段，将PCR产物进行切胶回收和克隆连接；使用Lasergene软件对GnRH基因的3
′
端、5
′
端和核心片段序列进行拼接，获得曼氏无针乌贼GnRH基因的cDNA全长序列；运用Predict Protein和Scratch Protein Predictor在线工具可用来对GnRH基因进行开放阅读框(ORF)预测，以及推测该ORF所编码的氨基酸序列，应用在线分析站点SignalP v3.0对氨基酸序列进行信号肽预测，应用NCBI对氨基酸序列进行Blast分析，应用ClustalW2对GnRH及其同源基因的氨基酸序列进行比对分析，前体蛋白相对分子质量同等电点pI的估算使用的是ExpasyProtParam在线分析软件，使用MEGAv5.0软件进行基于NJ法的进化树构建，重复1000次循环；神经肽基因克隆和序列分析过程中所用到的引物序列如表1所示。
[0013]表1 GnRH基因克隆与序列分析所需引物
[0014]Primer NamePrimer sequence(5
′‑3′
)GnRH
‑
FCAGACNCAAGCACARAAYTAGnRH
‑
RTYTCTATCAAAGCYTTTGT5
′‑
GnRH
‑
outterTTACCACCAGGGTGCCATCC5
′‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种曼氏无针乌贼神经肽的用途，其特征在于：所述曼氏无针乌贼神经肽在鱼类养殖过程中利用神经肽及其拮抗剂进行生殖调控的用途；所述的曼氏无针乌贼神经肽GnRH的基因cDNA全序列长432bp，开放阅读框(ORF)273bp，编码90个氨基酸，5
′‑
UTR 86bp，3
′‑
UTR 73bp；ORF包括一段长31个氨基酸的信号肽和44个氨基酸的辅助序列，以及12个氨基酸的成熟肽：pQNYHFSNGWHPG；前体...

【专利技术属性】
技术研发人员：迟长凤，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：