一种用于外泌体生产制备的系统及其制备外泌体的方法技术方案

本发明专利技术公开了一种用于外泌体生产制备的系统及其制备外泌体的方法，具体涉及生物医药领域。所述方法包括细胞培养和外泌体提取两部分。所述系统包括第一储存罐、第二储存罐、中空纤维细胞培养装置、切向流过滤装置、第一蠕动泵和第二蠕动泵。可应用于外泌体的工业化大规模生产制备。本发明专利技术提供的系统利用中空纤维装置中的大量的中空纤维管，增大了细胞培养面积，通过中空纤维管输送的培养基可促使细胞大量分泌外泌体，产出的外泌体溶液通过切向流过滤装置进行纯化，操作简单，回收率高，无中间污染的高纯度、高浓度的外泌体溶液。利用本发明专利技术的系统可以实现从细胞培养到外泌体生产的一体化制备流程，非常适合临床级的外泌体工业化大规模生产制备。大规模生产制备。大规模生产制备。

【技术实现步骤摘要】
一种用于外泌体生产制备的系统及其制备外泌体的方法


[0001]本专利技术涉及物医学
，具体涉及一种用于外泌体生产制备的系统及其制备外泌体的方法。

技术介绍

[0002]外泌体是有活细胞分泌的磷脂双分子层结构的小囊泡，直径在30
‑
150nm，密度在1.13
‑
1.19g/ml，可存在于各种体液中，如血清、血浆、唾液、尿液、腹水、脊髓液、乳汁等。外泌体中含有多种生物分子，如mRNA、miRNA、蛋白质、脂质等，可以传递给受体细胞，从而改变受体细胞的生理功能或病理功能。近几年，外泌体作为细胞间的信息传递工具及各种疾病的生物标志物而引起广泛的关注，外泌体具有在生物医药及疾病诊断领域的应用具有很大的潜力。
[0003]获得高纯度、高产量、标准化的外泌体，是外泌体用于临床应用的前提条件。然而，目前针对外泌体的提取纯化方法还没有统一的标准，常用的方法有很多种，超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、聚合物沉淀法、免疫捕获法等。超速离心法虽然是公认的外泌体提取的“金标准”方法，但是操作费时费力、高度依赖人工，回收率低，外泌体形态大小不一，高速离心会损害外泌体而影响下游实验。密度梯度离心法虽然可以获得很纯的外泌体，但该方法操作繁琐，重复性差，耗时很长，回收率低，不适合大批量提取外泌体。超滤法可以方便快速的提取外泌体，但该方法提取的外泌体中含有大颗粒杂质污染，严重影响下游应用。聚合物沉淀法操作简单方便，可以用于大体积样本的外泌体提取，但该方法提取的外泌体中杂蛋白污染较多，颗粒形态不均一，影响下游分析。免疫捕获法虽然可以特异性地捕获外泌体，获得的外泌体纯度高，但该方法成本高且产量低，不能提取样本中所有的外泌体，只能拿到某种表面抗原阳性的外泌体。所以，目前常用的外泌体提取方法只限于实验室操作，而且没有一种从细胞培养到外泌体提取的可工业化、可规模化的外泌体生产制备方法。因此，为了加速外泌体的临床转化，亟需一种从细胞培养到外泌体生产的一体化制备系统。

技术实现思路

[0004]为此，本专利技术提供一种用于外泌体生产制备的系统及其制备外泌体的方法，以解决现有提取外泌体耗时耗力、回收率低、中间过程污染严重、产量低、无法工业化大生产等问题。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]根据本专利技术一方面提供的一种用于外泌体制备的方法，述方法包括中空纤维细胞培养装置的细胞的培养和切向流过滤装置对外泌体的提取纯化。
[0007]进一步的，所述方法包括：
[0008]步骤一，将培养基加入第一储存罐中，开启第一蠕动泵，将第一储存罐的培养基注满中空纤维细胞培养装置后，关闭第一蠕动泵；
[0009]步骤二，将细胞通过中空纤维细胞培养装置的接种孔接种至中空纤维细胞培养装
置中，25℃培养8
‑
14h，使其充分贴壁在中空纤维管表面；
[0010]步骤三，开启第一蠕动泵，将第一储存罐中的培养基泵入中空纤维细胞培养装置中，同时含有外泌体的培养液流入第二储存罐内；
[0011]步骤四，收集外泌体溶液，开启第二蠕动泵，将第二储存罐中的外泌体泵入切向流过滤装置中，进一步对外泌体进行提取纯化；
[0012]步骤五，待第二储存罐中的液体体积浓缩至最小运行体积时，向第二储存罐中加入无菌PBS缓冲液，继续将第二储存罐中的液体泵入切向流过滤装置中，循环浓缩过滤，收集第二储存罐中的液体，即得到提取纯化的外泌体溶液。
[0013]进一步的，所述步骤一中，所述培养基中的营养成分的分子量小于20KD。
[0014]进一步的，所述步骤二中，所述细胞包括体细胞和干细胞及所述干细胞诱导分化的细胞。
[0015]进一步的，所述步骤二中，所述细胞的接种量为106‑
108个。
[0016]进一步的，所述步骤五中，所述切向流过滤装置的最小运行体积为50
‑
500mL。
[0017]根据本专利技术另一方面提供的一种用于上述方法制备外泌体的系统，其特征在于，所述系统包括第一储存罐、第二储存罐、中空纤维细胞培养装置、切向流过滤装置、第一蠕动泵和第二蠕动泵；
[0018]其中，第一储存罐的出口经第一蠕动泵与中空纤维细胞培养装置的入口连接，中空纤维细胞培养装置的出口与第一储存罐的入口连接，中空纤维细胞培养装置滤液出口与第二储存罐的第一入口连接；第二储存罐的出口经第二蠕动泵与切向流过滤装置的入口连接，切向流过滤装置的出口与第二储存罐的第二入口连接，经切向流过滤装置过滤后的液体直接流出体系。
[0019]进一步的，所述中空纤维细胞培养装置内部设有指标检测系统，包括pH检测模块、温度检测模块和溶氧检测模块；外壳设有透明可视窗。
[0020]进一步的，所述中空纤维细胞培养装置内部还设有中空纤维管，所述中空纤维管的截留分子量为20
‑
75KD。
[0021]进一步的，所述切向流过滤装置设有切向流过滤膜，所述切向流过滤膜的截留分子量为50
‑
750KD。
[0022]本专利技术具有如下优点：
[0023]本专利技术提供了一种用于外泌体大规模生产制备的系统以及利用该系统制备外泌体的方法和应用本专利技术的系统利用中空纤维装置中的大量的中空纤维管，增大了细胞培养面积，通过中空纤维管输送的培养基可促使细胞大量分泌外泌体，同时产出的外泌体溶液通过切向流过滤装置可以进一步对外泌体纯化，操作简单，回收率高，无中间污染的高纯度、高浓度的外泌体溶液。利用本专利技术的系统可以实现从细胞培养到外泌体生产的一体化制备流程，非常适合临床级的外泌体工业化大规模生产制备。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据
提供的附图引伸获得其它的实施附图。
[0025]本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本专利技术可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本专利技术所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本专利技术所揭示的
技术实现思路
得能涵盖的范围内。
[0026]图1为本专利技术提供的一种外泌体大规模生产制备的系统图，其中，1为第一储存罐，2为第一蠕动泵，3为中空纤维细胞培养装置，4为第二储存罐，5为第二蠕动泵，6为切向流过滤装置；
[0027]图2为本专利技术提供的中空纤维细胞培养装置结构图，其中，7为细胞接种口，8为中空纤维细胞培养系统的内腔，9为中空纤维管，10为细胞，11为透明可视窗，12为pH检测模块，13为温度检测模块，14为溶氧检测模块；
[0028]图3为本专利技术提供的中空纤维细胞培养装置原理图，其中，1为外泌体，2为细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于外泌体制备的方法，其特征在于，所述方法包括中空纤维细胞培养装置的细胞的培养和切向流过滤装置对外泌体的提取纯化。2.根据权利要求1所述用于外泌体制备的方法，其特征在于，所述方法包括：步骤一，将培养基加入第一储存罐中，开启第一蠕动泵，将第一储存罐的培养基注满中空纤维细胞培养装置后，关闭第一蠕动泵；步骤二，将细胞通过中空纤维细胞培养装置的接种孔接种至中空纤维细胞培养装置中，25℃培养8
‑
14h，使其充分贴壁在中空纤维管表面；步骤三，开启第一蠕动泵，将第一储存罐中的培养基泵入中空纤维细胞培养装置中，同时含有外泌体的培养液流入第二储存罐内；步骤四，收集外泌体溶液，开启第二蠕动泵，将第二储存罐中的外泌体泵入切向流过滤装置中，进一步对外泌体进行提取纯化；步骤五，待第二储存罐中的液体体积浓缩至最小运行体积时，向第二储存罐中加入无菌PBS缓冲液，继续将第二储存罐中的液体泵入切向流过滤装置中，循环浓缩过滤，收集第二储存罐中的液体，即得到提取纯化的外泌体溶液。3.根据权利要求2所述用于外泌体制备的方法，其特征在于，所述步骤一中，所述培养基中的营养成分的分子量小于20KD。4.根据权利要求2所述用于外泌体制备的方法，其特征在于，所述步骤二中，所述细胞包括体细胞和干细胞及所述干细胞诱导分化的细胞。5.根据权利要求2所述用于外泌体制备的方法，其特征在于，所述步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海心，
申请(专利权)人：瑞太生物科技沈阳有限公司，
类型：发明
国别省市：