具有融合前早期构象的SARS-CoV-2S三聚体蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术提供了具有融合前早期构象的SARS

【技术实现步骤摘要】
具有融合前早期构象的SARS
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CoV
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2 S三聚体蛋白及其应用


[0001]本专利技术涉及病毒学领域。具体而言，本专利技术提供了具有融合前早期构象的SARS
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CoV
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2 S三聚体蛋白，及其制备方法。本专利技术还涉及呈现该种构象的冠状病毒S蛋白在诊断、预防和治疗新型冠状病毒感染和导致疾病的用途。

技术介绍

[0002]冠状病毒，英文简写CoV，全称Coronavirus：Corona(冕、冠)+Virus(病毒)＝冠状病毒。“冠状病毒”因在电子显微镜下呈现的标志性冠状结构而得名，该结构为S糖蛋白在病毒包膜表面形成的刺突。
[0003]冠状病毒颗粒呈圆形或椭圆形，亦为多形性，直径50～200nm，属于尺寸较大的病毒。冠状病毒是包膜病毒，病毒衣壳外面包裹着脂质包膜，其上排列较宽的刺突(S蛋白)，形状如太阳光环。S蛋白位于病毒表面，形成棒状结构，作为病毒的主要抗原蛋白之一，介导受体结合和细胞融合的主要抗原。负责识别宿主细胞表面的受体，可刺激机体产生中和抗体。
[0004]已知冠状病毒中，有7种可引发人类疾病，包括：HCoV
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229E、HCoV
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OC43、HCoV
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NL63、HCoV
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HKU1、SARS
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CoV、MERS
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CoV和SARS
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CoV
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2。其中，前4种为局部流行性疾病，主要引起轻度自限性疾病，而SARS
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CoV和MERS
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CoV可引发重症。2002年和2012年发现的SARS
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CoV和MERS
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CoV属于β
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冠状病毒，并由于其对人类的高威胁性被列入WHO高威胁清单。SARS
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CoV
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2(sever acute respiratory syndrome coronaviruses 2，严重急性呼吸综合征冠状病毒2)是第七个能够引发人类疾病的离散冠状病毒种属，表征为β
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冠状病毒。冠状病毒引发的高患病率对人类健康构成持续威胁。
[0005]SARS
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CoV
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2基因组全长约29,800个碱基对(base pair，bp)，基因组一般含有13个基因，编码14个蛋白，主要包括多聚蛋白(polyprotein)、刺突蛋白(spike protein，S)、基质蛋白(matrix protein，M)、囊膜蛋白(envelop protein，E)和衣壳蛋白(nucelocapsid protein，N)及其他此类病毒特有蛋白。其中主要的膜蛋白S，含S1和S2两个亚基，S1上含有N端结构域NTD，受体结合域RBD，及两个连接功能域SD1和SD2。
[0006]冠状病毒属于囊膜病毒，囊膜病毒通过与靶细胞膜的融合入侵宿主细胞。其中，冠状病毒属于I类囊膜病毒，包含HIV、流感病毒、埃博拉病毒等。I类囊膜病毒的病毒膜融合由病毒表面主要糖蛋白介导，冠状病毒S糖蛋白前体具有蛋白酶切割位点，成熟后会被宿主切割成S1和S2两个亚基，S1/S2裂解位点位于残基660
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675的灵活环中，该残基在预融合S1
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S2三聚体峰中完全暴露。要成功感染SARS
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CoV，需要宿主细胞蛋白酶切割S1/S2位点。冠状病毒成熟过程中，该类病毒在膜融合前后会发生显著构象变化，融合前构象为prefusion，S1和S2维持完整的三聚体构象，融合后的构象为postfusion,S1蛋白与受体结合，触发一系列构象变化，且在蛋白水解酶和细胞内吞泡的酸性条件下，导致S2构象延长，S2高度疏水的N端融合肽FP锚定在宿主细胞上。S2三聚体重折叠成高度稳定的构象，诱导六螺旋束的形成，完成膜融合。
[0007]特别的，在β冠状病毒中，在融合前构象中，S蛋白中的S1也会经历特殊的构象变
化，该构象变化为β冠状病毒所特有，其他型目前还没有发现。
[0008]目前已证实，新型冠状病毒的受体与SARS
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CoV一样都是血管紧张素转化酶2(ACE2)。基于利用冷冻透射电子显微镜单颗粒分析(cryo
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EM，single particle analysis，SPA)解析的SARS
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CoV的S糖蛋白与其宿主细胞受体ACE2的复合结构，早期研究表明，SARS
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CoV病毒与受体结合前，三聚体S糖蛋白中的受体结合域RBD为“向下”构象，当病毒与受体结合时，其中一个RBD采用突出的“向上”构象与ACE2结合，从而诱导其他两个RBD也与受体结合。同时在MERS
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CoV S糖蛋白中也有类似的观察，显示RBD“向上”突出。最新利用冷冻电镜解析的新型冠状病毒SARS
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CoV
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2的S蛋白结构也有一个RBD“向上”的构象变化。由于S三聚体糖蛋白是冠状病毒与细胞受体结合介导病毒入胞和感染并致病的重要蛋白，因此成为诊断、预防和治疗病毒感染和致病的主要靶标，然而，S蛋白的变构现象及其呈现多种的不同构象与机体产生的免疫反应相关，给研究带了极大的挑战，截至目前鉴定的S三聚体蛋白呈现为融合前(prefusion)和融合后(postfusion)两种构象，融合前构象呈现为亚稳态(metastable)构象，在受体刺激或其他条件作用下自发变构成为融合后构象，病毒S变成融合后构象时已经处于感染入胞状态，因此，针对融合前构象S蛋白开发疫苗或药物将具有更好的病毒中和作用和抑制病毒复制效果，而使得稳定S蛋白融合前构象及其表位研究成为冠状病毒的研究重点。

技术实现思路

[0009]本申请的专利技术人经过大量实验和反复摸索，出人意料地获得了具有早期融合前构象的SARS
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CoV
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2的S三聚体，该构象区别于已知的融合前构象，并且对SARS
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CoV
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2的诊断、预防及治疗具有更好的效果，由此完成了本专利技术。
[0010]因此，在第一方面，本专利技术提供了一种融合蛋白，其包含严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS
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CoV
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2)的S蛋白或其变体序列、以及三聚化结构域序列；
[0011]其中，所述S蛋白变体与野生型S蛋白(例如SEQ ID NO:1所示的S蛋白)相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加)，或者与野生型S蛋白相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性，并且所述S蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.融合蛋白，其包含严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS
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CoV
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2)的S蛋白或其变体序列、以及三聚化结构域序列；其中，所述S蛋白变体与野生型S蛋白(例如SEQ ID NO:1所示的S蛋白)相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加)，或者与野生型S蛋白相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性，并且所述S蛋白变体具有野生型S蛋白的免疫学活性(例如，在受试者中诱导针对SARS
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CoV
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2的特异性免疫应答如中和抗体应答的活性)。2.权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述三聚化结构域序列包含如SEQ ID NO:3所示的序列。3.权利要求1或2所述的融合蛋白，其中，所述S蛋白变体在其S1结构域和S2结构域之间不包含弗林蛋白酶识别位点；优选地，与野生型S蛋白相比，所述S蛋白变体在相应于如下位置的氨基酸位置中的一处或多处(例如1处，2处或3处)包含氨基酸置换，所述如下位置参考野生型S蛋白所示的氨基酸位置：668、669、671；优选地，所述S蛋白变体包含选自下列的1个或几个(例如1个，2个或3个)氨基酸置换：在相应于野生型S蛋白的位置668的位置上的氨基酸置换为A，在相应于野生型S蛋白的位置669的位置上的氨基酸置换为G，在相应于野生型S蛋白的位置671的位置上的氨基酸置换为G；优选地，与野生型S蛋白相比，所述S蛋白变体在与野生型S蛋白的第668
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671位相对应的位置上的氨基酸残基被置换为AGAG。4.权利要求1
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3任一项所述的融合蛋白，其中与野生型S蛋白相比，所述S蛋白变体在与野生型S蛋白的第972位和/或第973位相对应的位置上包含氨基酸置换；优选地，所述S蛋白变体包含：在相应于野生型S蛋白的位置972的位置上的氨基酸置换为P，和/或在相应于野生型S蛋白的位置973的位置上的氨基酸置换为P。5.权利要求1
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4任一项所述的融合蛋白，其中，所述S蛋白包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；优选地，所述S蛋白变体包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。6.权利要求1
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5任一项所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白从N端至C端包含所述S蛋白或其变体的序列和三聚化结构域序列。7.权利要求1
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6任一项所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白在所述S蛋白或其变体序列和三聚化结构域序列之间进一步包含蛋白酶识别位点序列；优选地，所述蛋白酶是凝血酶；优选地，所述蛋白酶识别位点序列包含如SEQ ID NO:4或5所示的序列。8.权利要求1
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7任一项所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含选自下列的氨基酸序列：(1)由SEQ ID NO:6所示序列的第1位至第1238位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(2)由SEQ ID NO:8所示序列的第1位至第1238位氨基酸残基构成的氨基酸序列。9.权利要求1
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8任一项所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白进一步包含载体蛋白序
列；优选地，所述载体蛋白序列位于所述S蛋白或其变体序列的N端，或者所述三聚化结构域序列的C端；优选地，所述载体蛋白选自CRMA(例如SEQ ID NO:10所示的CRMA)、CRM389(例如SEQ ID NO:11所示的CRM389)或CRM197(例如SEQ ID NO:12所示的CRM197)；优选地，所述载体蛋白序列与其相邻结构域之间任选地通过肽接头连接；优选地，所述肽接头是(GmS)n，其中m选自1
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4的整数(例如1，2，3，4)，n选自1
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3的整数(例如1，2，3)；优选地，所述融合蛋白包含选自下列的氨基酸序列：(1)由SEQ ID NO:13所示序列的第1位至第1443位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(2)由SEQ ID NO:14所示序列的第1位至第1443位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(3)由SEQ ID NO:15所示序列的第1位至第1642位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(4)由SEQ ID NO:16所示序列的第1位至第1642位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(5)由SEQ ID NO:17所示序列的第1位至第1788位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(6)由SEQ ID NO:18所示序列的第1位至第1788位氨基酸残基构成的氨基酸序列。10.权利要求1
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9任一项所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含标签序列(例如所述标签序列是纯化标签，例如多组氨酸标签、myc标签或HA标签)；优选地，所述标签序列位于所述融合蛋白的N端或C端；优选地，所述标签序列与其相邻结构域之间任选地通过肽接头或酶切位点序列连接；优选地，所述融合蛋白包含SEQ ID NOs:13
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18任一项所示的序列。11.多聚体，其包含权利要求1
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10任一项所述的融合蛋白；优选地，所述多聚体是同源多聚体；优选地，所述多聚体是三聚体；优选地，所述多聚体是由相同的所述融合蛋白所形成的三聚体。12.分离的核酸分子，其包含编码权利要求1
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10任一项所述的融合蛋白的核苷酸序列。13.载...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾颖，郑清炳，李婷婷，俞海，薛文辉，陈婷婷，李少伟，夏宁邵，
申请(专利权)人：厦门万泰沧海生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：