具有降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物制造技术

本文提供了包含相对于亲本胰岛素的至少一个突变的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物包含位置B16处被疏水性氨基酸取代的突变和/或位置B25处被疏水性氨基酸取代的突变。和/或位置B25处被疏水性氨基酸取代的突变。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物
[0001]本文提供了包含相对于亲本胰岛素的至少一个突变的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物包含位置B16处被疏水性氨基酸取代的突变和/或位置B25处被疏水性氨基酸取代的突变。

技术介绍

[0002]在世界范围内，超过4亿人患有1型或2型糖尿病。1型糖尿病用胰岛素替代治疗。与1型糖尿病相比，2型糖尿病基本没有胰岛素缺乏，但是在大量病例中，尤其是在晚期，2型糖尿病患者用胰岛素治疗。
[0003]在健康人中，胰腺的胰岛素释放与血糖浓度严格相关。血糖水平升高，如饭后发生，并且通过相应的胰岛素分泌增加迅速补偿。在空腹状态下，血浆胰岛素水平降至基础值，这足以保证连续向胰岛素敏感的器官和组织供应葡萄糖并且在夜间保持低的肝葡萄糖产生。通常，通过外源性(主要是皮下)施用胰岛素代替内源性胰岛素分泌不能达到上述血糖的生理性调节的质量。可能发生血糖向上或向下的偏差，这可能以最严重的形式危及生命。由此可得出，改善的糖尿病疗法主要旨在将血糖尽可能接近地保持在生理范围内。
[0004]人胰岛素是51个氨基酸的多肽，其分为2条氨基酸链：具有21个氨基酸的A链和具有30个氨基酸的B链。所述链借助2个二硫桥彼此连接。在A链的位置6与11处的半胱氨酸之间存在第三个二硫桥。目前用于治疗糖尿病的一些产品是胰岛素类似物，即胰岛素变体，其序列与人胰岛素序列的不同之处在于A链和/或B链中的一个或多个氨基酸取代。
[0005]与许多其他肽激素一样，人胰岛素的体内半衰期很短。因此，它被频繁施用，这与患者的不适相关。因此，需要这样的胰岛素类似物，其具有增加的体内半衰期，并且因此具有延长的作用持续时间。
[0006]当前有不同的方法来延长胰岛素的半衰期。
[0007]一种方法是基于开发在低pH下可溶，但是在生理pH下相对于天然胰岛素具有降低的溶解度的配制品。通过在B链的C末端添加两个精氨酸来增加胰岛素类似物的等电点。两个精氨酸的添加与A21处的甘氨酸取代的组合(甘精胰岛素)提供了具有延长的作用持续时间的胰岛素。胰岛素类似物在皮下部位注射时在锌的存在下沉淀并且缓慢溶解，这导致甘精胰岛素的持续存在。
[0008]在另一种方法中，使长链脂肪酸基团与胰岛素的LysB29的ε氨基缀合。此基团的存在允许胰岛素通过非共价的可逆结合与血清白蛋白附接。因此，此胰岛素类似物相对于人胰岛素具有显著延长的时间
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作用曲线(参见例如May er等,Inc.Biopolymers(Pept Sci)88:687
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713,2007；或WO 2009/115469)。
[0009]WO 2016/006963公开了与人胰岛素相比具有降低的胰岛素受体介导的清除率的胰岛素类似物。
[0010]WO 2018/056764公开了与人胰岛素相比具有降低的胰岛素受体介导的清除率的胰岛素类似物。
[0011]WO 2008/034881公开了蛋白酶稳定的胰岛素类似物。
[0012]为了增加药物的作用持续时间，半衰期起着主要作用。半衰期(t
1/2
)与分布体积除以清除率成比例。在人胰岛素的情况下，清除主要是通过与胰岛素受体的结合、内化和随后的降解来驱动的。
[0013]因此，需要这样的胰岛素类似物，其具有降低的胰岛素受体结合活性，并且因此具有降低的受体介导的清除率，但是具有允许充分降低体内血糖水平的信号转导活性。

技术实现思路

[0014]本文提供了长效胰岛素类似物，其具有非常低的结合亲和力(因此具有较低的清除率)，同时仍维持高信号转导。
[0015]出乎意料地是，在作为本专利技术的基础的研究的上下文中显示，在人胰岛素的位置B16和/或B25处用疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸和色氨酸)取代导致胰岛素受体结合活性降低(与亲本胰岛素的胰岛素受体结合活性相比，参见实施例)。观察到用支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)取代对胰岛素受体结合活性的影响最强。有趣的是，基于它们的胰岛素受体亚型B(IR
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B)结合亲和力，在这些位置处(如位置B25处)具有此类取代的胰岛素类似物显示出与预期相比高达6倍的信号转导增强(参见实施例)。此外，一些测试的胰岛素类似物显示出对α
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胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶D和胰岛素降解酶的改善的蛋白水解稳定性(参见实施例)。
[0016]因此，本文提供了包含相对于亲本胰岛素的至少一个突变的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物包含位置B16处被疏水性氨基酸取代的突变和/或位置B25处被疏水性氨基酸取代的突变。在一些实施方案中，提供了一种胰岛素类似物，其包含相对于亲本胰岛素的至少一个突变，其中所述胰岛素类似物包含位置B16处被支链氨基酸取代的突变和/或位置B25处被支链氨基酸取代的突变。
[0017]如本文所用，表述“胰岛素类似物”是指具有这样的分子结构的肽，所述分子结构可以通过缺失和/或取代在天然存在的胰岛素(本文也称为“亲本胰岛素”，例如人胰岛素)中存在的至少一个氨基酸残基和/或添加至少一个氨基酸残基而在形式上衍生自天然存在的胰岛素的结构。所添加和/或交换的氨基酸残基可以是可编码氨基酸残基或其他天然存在的残基或纯合成的氨基酸残基。如本文所指的类似物能够降低体内的血糖水平，如在人类受试者中。
[0018]在一些实施方案中，本文提供的胰岛素类似物包含两条肽链，即A链和B链。通常，两条链通过半胱氨酸残基之间的二硫桥连接。例如，在一些实施方案中，本文提供的胰岛素类似物包含三个二硫桥：一个二硫桥在位置A6与A11处的半胱氨酸之间，一个二硫桥在A链的位置A7处的半胱氨酸与B链的位置B7处的半胱氨酸之间，并且一个在A链的位置A20处的半胱氨酸与B链的位置B19处的半胱氨酸之间。因此，本文提供的胰岛素类似物可以包含位置A6、A7、A11、A20、B7和B19处的半胱氨酸残基。
[0019]在本文提供的一些实施方案中，所述胰岛素类似物是单链胰岛素。单链胰岛素是单条多肽链，其中胰岛素B链经由未切割的连接肽与胰岛素A链连续连接。
[0020]胰岛素的突变(即亲本胰岛素的突变)在本文中通过参考链(即类似物的A链或B链)、A链或B链中突变的氨基酸残基的位置(如A14、B16和B25)和取代亲本胰岛素中天然氨基酸的氨基酸的三字母密码来指示。术语“desB30”是指缺乏来自亲本胰岛素的B30氨基酸
的类似物(即位置B30处的氨基酸不存在)。例如，Glu(A14)Ile(B16)desB30人胰岛素是这样的人胰岛素类似物，其中人胰岛素A链位置14(A14)处的氨基酸残基被谷氨酸取代，B链位置16(B16)处的氨基酸残基被异亮氨酸取代，并且B链位置30处的氨基酸被缺失(即不存在)。
[0021]本文提供的胰岛素类似物包含相对于亲本胰岛素的至少一个突变(氨基酸的取代、缺失或添加)。如本文所用，术语“至少一个”意指一个或超过一个，如“至少两个”、“至少三个”、“至少四个”、“至少本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种胰岛素类似物，其包含相对于亲本胰岛素的至少一个突变，其中所述胰岛素类似物包含位置B16处被支链氨基酸取代的突变和/或位置B25处被支链氨基酸取代的突变。2.根据权利要求1所述的胰岛素类似物，其中所述亲本胰岛素是人胰岛素、猪胰岛素或牛胰岛素。3.根据权利要求1和2所述的胰岛素类似物，其中所述支链氨基酸选自缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu)。4.根据权利要求1至3中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物进一步包含位置A14处被选自谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)和组氨酸(His)的氨基酸取代的突变。5.根据权利要求1至4中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物进一步包含位置B30处的突变。6.根据权利要求5所述的胰岛素类似物，其中位置B30处的所述突变是所述亲本胰岛素的位置B30处的氨基酸的缺失(Des(B30)
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突变)。7.根据权利要求1至6中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物进一步包含位置B3处被谷氨酸(Glu)取代的突变。8.根据权利要求1至7中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素进一步包含位置A21处被甘氨酸(Gly)取代的突变。9.根据权利要求1至8中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物的B链包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK(SEQ ID NO:22)FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO:44)FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO:48)FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO:50)FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO:58)FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO:60)FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO:64)FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO:66)FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO:70)FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO:76)FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO:78)FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO:80)FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPKT(SEQ ID NO:85)FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO:86)FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO:87)FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO:88)FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO:89)FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO:90)FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO:91)FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO:92)FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO:93)
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO:94)FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO:95)FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO:96)和FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO:97)。10.根据权利要求1至9中任一项所述的胰岛素类似物，其包含(a)具有如SEQ ID NO:43(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO:44(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK)所示的氨基酸序列的B链，(b)具有如SEQ ID NO:47(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO:48(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK)所示的氨基酸序列的B链，或(c)具有如SEQ ID NO:77(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO:78(FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK)所示的氨基酸序列的B链。11.一种胰岛素类似物，其选自：Leu(B16)
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人胰岛素、Val(B16)
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人胰岛素、Ile(B16)
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人胰岛素、Leu(B16)Des(B30)
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人胰岛素、Val(B16)Des(B30)
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：赛诺菲，
类型：发明
国别省市：