利用放射线制备减毒活疫苗的方法及通过其制备的减毒活疫苗组合物技术

本发明专利技术涉及利用放射线制备减毒活疫苗的方法及通过其制备的减毒活疫苗组合物，更具体地，涉及如下的利用放射线制备减毒活疫苗的方法和减毒活疫苗组合物，所述利用放射线制备减毒活疫苗的方法包括以单次0.5～2kGy的剂量向病原微生物反复照射6～15次放射线的步骤，所述减毒活疫苗组合物包括减毒的病原微生物，所述减毒的病原微生物通过放射线的照射而发生核苷酸插入和核苷酸缺失中的至少一种突变，以使得所述减毒的病原微生物无法恢复(revertant)为野生型。(revertant)为野生型。(revertant)为野生型。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用放射线制备减毒活疫苗的方法及通过其制备的减毒活疫苗组合物


[0001]本专利技术涉及利用放射线制备减毒活疫苗的方法及通过其制备的减毒活疫苗组合物，更具体地，涉及利用放射线制备非侵入性(non
‑
invasive)减毒活疫苗的方法及通过其制备的疫苗组合物。

技术介绍

[0002]温血动物克服微生物引起的疾病的方法是一个复杂的过程。可以通过预先使温血动物呈现减弱的致病性状态，获得对于微生物引起的疾病的免疫。
[0003]一般情况下，以毒性减弱的活微生物为主要成分的疫苗被称为减毒疫苗或活疫苗等。与灭活疫苗相比，这些疫苗被认为可以诱导极为有效的免疫反应。动物宿主预防接种疫苗后，当微生物致病菌黏附到宿主体内时，此类疫苗可以加快早期免疫、细胞媒介性免疫或者体液免疫的恢复速度，在出现临床上显著的感染率之前，控制有机体的进一步增殖。已知以灭活病原菌为主要成分的疫苗，即灭活疫苗则无法诱导此类反应。
[0004]但是，包含减毒活病原菌的疫苗根据减毒程度在预防接种时，存在无法排除所预防接种的宿主会患上所要预防的疾病的风险。因此，需要研制具备免疫属性且在接种时不会引起不良副作用的疫苗，减毒活疫苗株实质上应不存在恢复到毒性野生型菌株的可能性。
[0005]现有的减毒活疫苗(live attenuated vaccine)制备技术包括：长时间在培养基中移种培养的方法，以便通过自然突变法减弱或消除病原微生物毒性；以及将毒性化学物质或者紫外线(UV)适用作突变原(mutagen)的方法等，以便通过人工诱变法增加基因突变率(mutation rate)。然而前者通过自发的基因突变(spontaneous DNA mutation)产生，因此获得疫苗株需要5～10年的长时间。与自然突变方式相比，后者可以将研发时间缩短为2～3年左右，然而由于现有的减毒活疫苗制备技术大部分仅诱导由碱基置换(base substitution)引起的点突变(point mutation)，因此当变异的碱基恢复为原型(back mutation)时恢复病原性，从而具有使得减毒疫苗转化为带有病原性的逆转株(revertant)的问题，作为例子，可以举出1998年普及的布鲁氏疫苗菌株回复为高致病性病原体致2万头牛死亡的事件。
[0006]通过照射放射线制备疫苗的技术已经应用于灭活微生物的灭活疫苗的制备，然而如US2016
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0089430A1中所示，利用其制备减毒活疫苗的技术还未公开，如果可以在短时间内利用放射线获得减毒的大量病原微生物减毒株(attenuated strain)，则可以期待对缩短减毒疫苗的研发时间方面作出巨大贡献。

技术实现思路

[0007]技术课题
[0008]本专利技术的一个方面提供可以在短时间内获得减毒的大量病原微生物减毒株
(attenuated strain)的方法。
[0009]本专利技术的另一方面提供一种不可能恢复为野生型菌株的减毒的病原微生物减毒株(attenuated strain)。
[0010]课题解决手段
[0011]根据本专利技术的一个方面，提供一种利用放射线制备减毒活疫苗的方法，所述方法包括以0.5～2kGy的剂量向病原微生物反复照射6～15次的步骤。
[0012]根据本专利技术的另一个方面，提供一种减毒活疫苗组合物，包括减毒的病原微生物，该减毒的病原微生物通过放射线的照射而发生核苷酸插入和核苷酸缺失中的至少一种突变，以使得所述减毒的病原微生物无法恢复(revertant)为野生型。
[0013]专利技术效果
[0014]根据本专利技术，可以通过反复照射放射线诱导现有突变方式中不会发生的核苷酸插入(nucleotide insertion)和核苷酸缺失(nucleotide deletion)，在短时间内获得不发生恢复(revertant)为突变体的问题的安全的减毒活疫苗，因此可以缩短减毒疫苗的研发时间。
附图说明
[0015]图1为示出放射线不同照射次数下动物细胞的入侵能力及增殖程度的图表。
[0016]图2(a)为示出放射线不同照射剂量下的巨噬细胞感染率的图表，图2(b)为示出放射线不同照射剂量下的沙门氏菌灭活程度的图表。
[0017]图3为示出将制备例1获得的十个菌落培养在LB培养基中而确认入侵能力和增殖程度的结果的图表。
[0018]图4为示出小鼠受到制备例1获得的十个菌落中所获取的菌株感染并确认小鼠存活程度的结果的图表。
[0019]图5为示出确认制备例1获得的十个菌落中所获取的菌株的肠道内停留能力的结果的图表。
[0020]图6为示出根据疫苗投放与否的血清中IgM和IgG的形成率。
[0021]图7为示出根据疫苗投放与否的粪便中IgA形成率。
[0022]图8为示出鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的攻击感染实验中的小鼠存活率比较结果。
[0023]图9为示出肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的攻击感染实验中的小鼠存活率比较结果。
[0024]图10为示出金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的攻击感染实验中的小鼠存活率比较结果。
[0025]最佳实施方式
[0026]以下将参考附图说明本专利技术的优选实施例。然而，本专利技术的实施例可以以多种其他形式来变型，且本专利技术的范围不限于下面描述的实施例。
[0027]根据本专利技术，提供一种利用放射线制备非侵入性(non
‑
invasive)减毒活疫苗的方法及通过其制备的疫苗组合物。
[0028]更具体地，本专利技术的利用放射线制备减毒活疫苗的方法包括以单次0.5～2kGy的
剂量向病原微生物反复照射6～15次放射线的步骤；优选的，放射线照射剂量大于等于0.5kGy且小于2kGy，例如为1～1.5kGy，更优选约为1kGy。
[0029]所述单次放射线剂量不足0.5kGy时，由于无法形成充分的突变，无法获取减毒疫苗，反之，当放射线单次剂量超过2kGy时，由于病原微生物被灭活，则会出现无法获得减毒活疫苗的问题。
[0030]本专利技术中所述利用放射线制备减毒活疫苗的方法包括向病原微生物照射0.5～2kGy剂量的放射线的步骤；及培养所照射放射线的病原微生物的步骤，所述照射放射线的步骤及培养病原微生物的步骤可以反复执行共6～15次。
[0031]本专利技术中所述放射线可以反复照射共6～15次，优选反复照射共10～12次。如图1(a)所示，所述放射线的反复照射次数不足6次时，由于病原菌细胞的入侵能力未充分降低，将出现无法确保稳定性的问题，而所述放射线的反复照射次数超过15次时，由于突变后显现抑制成长的效果，所以无法使用为疫苗菌株。
[0032]可适用本专利技术的所述病原微生物可以由埃希氏菌(Escherichia)属、沙门氏菌(Salmonella)属、弧菌(Vibrio)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种利用放射线制备减毒活疫苗的方法，其中，所述利用放射线制备减毒活疫苗的方法包括以单次0.5～2kGy的剂量向病原微生物反复照射6～15次放射线的步骤。2.根据权利要求1所述的利用放射线制备减毒活疫苗的方法，其中，所述利用放射线制备减毒活疫苗的方法包括：以单次0.5～2kGy的剂量向病原微生物照射放射线的放射线照射步骤；以及培养所照射放射线的病原微生物的病原微生物培养步骤，所述放射线照射步骤和所述病原微生物培养步骤反复执行共6～15次。3.根据权利要求1所述的利用放射线制备减毒活疫苗的方法，其中，所述放射线反复照射共10～12次。4.根据权利要求1所述的利用放射线制备减毒活疫苗的方法，其中，所述病原微生物从由埃希氏菌属、沙门氏菌属、弧菌属、链球菌属、鲍特菌属、分枝杆菌属和葡萄球菌属组成的组中选择。5.根据权利要求1所述的利用放射线制备减毒活疫苗的方法，其中，所述病原微生物是鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、肺炎链球菌或金黄色葡萄球菌。6.根据权利要求1所述的利用放射线制备减毒活疫苗的方法，所述培养所照射放射线的病原微生物的微生物培养步骤执行6～48小时。7.一种减毒活疫苗组合物，其中，所述减毒活疫苗组合物包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐昊成，林相蓉，郑钟炫，
申请(专利权)人：韩国原子力研究院，
类型：发明
国别省市：