一种用于检测miRNA的引物和探针组合的设计方法及其应用技术

本发明专利技术涉及qPCR检测技术领域，尤其涉及一种用于检测miRNA的引物和探针组合的设计方法及其应用。设计方法包括：针对待测miRNA的核苷酸序列，设计特异性长链引物RT、特异性短链引物PF、通用短链引物PR和通用探针PP；特异性长链引物RT包括非特异的通用序列Q1和特异性的序列Q2；特异性的序列Q2为与待测miRNA的3

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测miRNA的引物和探针组合的设计方法及其应用


[0001]本专利技术涉及qPCR检测
，尤其涉及一种用于检测miRNA的引物和探针组合的设计方法及其应用。

技术介绍

[0002]近几年miRNA在细胞分化，生物发育及疾病发生发展等过程中发挥了巨大作用，随着现有技术对miRNA作用机理的深入研究，以及利用最新的如miRNA芯片等高通量的技术手段对miRNA和疾病之间的关系进行研究，使人们对于高等真核生物基因表达调控网络的理解提升到了一个崭新的高度。自从囊泡运输调控机制被公开，外泌体已然成为临床医学研究的一大热点，而miRNA可以作为标志物对外泌体的功能进行表征，对于外泌体在疾病诊断和载药治疗的应用和发展有非常重要的意义，引起研究人员越来越多的的关注。
[0003]miRNA有多种形式，最原始的是pri
‑
miRNA，长度大约为300~1000bp；pri
‑
miRNA经过一次加工后，成为pre
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miRNA即miRNA前体，长度大约为70~90bp；pre
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miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约19~24nt的成熟miRNA。成熟的miRNA具有高度保守性，时序性和组织特异性，在细胞内具有多种重要的调节作用。目前检测miRNA的方法主要有Northern印迹分析，微点阵(microarray)分析和实时定量PCR(quantitative Real
‑
Time PCR)三种方法。实时定量PCR相比Northern印迹和微点阵需要较少的样本（1
‑
10ng），并且能够显著的提高检测的范围和灵敏度，是目前应用最广泛、最成熟的技术。目前用于检测miRNA的定量PCR方法有2种，一种是加尾法，另一种是颈环法。
[0004]加尾法合成加长版的第一链cDNA有2个步骤，首先在Poly（A）聚合酶的作用下对miRNA添加Ploy（A）尾巴，增加其长度，之后在逆转录酶的作用下使反转录引物结合到Ploy（A）序列上，完成加长版第一链cDNA的合成。但由于Poly（A）聚合酶对RNA无差别添加Ploy（A）尾巴，逆转录引物也无特异性，直接导致加尾法检测结果可能为pre
‑
miRNA和成熟miRNA的总和，特异性比较差。
[0005]颈环法使用特异性颈环引物对miRNA进行反转录，特异性颈环引物中有6
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8个碱基与miRNA的3
’
端序列互补，理论上只对成熟的miRNA进行反转，之后通过特异性正向引物、特异性探针和通用反向引物实现miRNA的qPCR检测，其特异性高，可区分单碱基差异的同一家族中同源的miRNA；但由于特异性探针的使用使得颈环法的成本大大提高，特异性探针的合成周期也较长，如果实验需要检测较多的miRNA，则无论对研究人员个人还是服务型公司的成本都有较高的要求。
[0006]经典的加尾法与颈环法都有自身固有的缺点，因此在维持原有检测效果的基础上，经典的加尾法与颈环法还有待于改善和发展。

技术实现思路

[0007]为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供一种用于检测miRNA的引物和探针组合的设计方法及其应用。
[0008]第一方面，本专利技术提供一种用于检测miRNA的引物和探针组合的设计方法，包括：针对待测miRNA的核苷酸序列，设计特异性长链引物RT、特异性短链引物PF、通用短链引物PR和通用探针PP；所述特异性长链引物RT包括非特异的通用序列Q1和特异性的序列Q2；所述的特异性的序列Q2为与所述待测miRNA的3
’
端起的4
‑
8个碱基互补的特异性序列；所述的特异性短链引物PF包括保护碱基和与待测miRNA的5
’
端起始的12
‑
18个碱基相同的序列所述通用序列Q1包括：所述通用短链引物PR和所述通用探针PP的核苷酸序列。
[0009]进一步地，所述特异性长链引物RT从5
’
至3
’
依次包括：通用性短链引物PR、通用性探针PP、11个oligo（dT）序列和所述待测miRNA的3
’
端起的4
‑
8个碱基互补的特异性序列。
[0010]进一步地，所述特异性长链引物RT的长度为50
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60个碱基；所述特异性短链引物PF的长度为16
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25个碱基，TM值为58
‑
62℃之间；所述通用短链引物PR的长度为18个碱基，TM值为58
‑
62℃之间；所述通用探针PP的长度为14个碱基，TM值为64
‑
70℃之间。
[0011]进一步地，所述通用探针PP两端分别标记淬灭基团和荧光基团；优选为MGB修饰的通用探针。
[0012]本专利技术进一步提供所述设计方法设计得到的引物和探针组合。
[0013]第二方面，本专利技术提供一种试剂盒，所述试剂盒包括所述引物和探针组合。
[0014]第三方面，本专利技术提供一种检测样品中miRNA的方法，包括：采用所述设计方法设计得到的引物和探针组合，或所述的引物和探针组合，或所述试剂盒对样品进行荧光实时定量PCR检测。
[0015]进一步地，所述方法不用于诊断和治疗目的。本领域技术人员可以理解，上述引物和探针组合的设计方法，设计得到的引物和探针组合可适用于多种形式的miRNA检测，特别是科研研究过程中。
[0016]进一步地，所述荧光实时定量PCR检测中：所述特异性长链RT的终浓度为0.1~0.5 μM；和/或，所述特异性短链引物PF的终浓度为2~5μM；和/或，所述通用短链引物PR的终浓度为2~5μM；和/或，所述通用探针PP的终浓度为2~5μM。
[0017]进一步地，所述荧光实时定量PCR检测的PCR程序为：95
‑
98℃ 30s；95
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98℃ 5s，58
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62℃ 30s，50个循环；40℃保持。
[0018]本专利技术进一步提供所述引物和探针组合或所述试剂盒在检测外泌体miRNA标志物中的应用。
[0019]进一步地，所述外泌体miRNA来源于动物的血浆、组织或体液；或人的血浆、组织或体液。如上仅为举例，实际应用时不限于这些样本。
[0020]本专利技术具备如下有益效果：本专利技术将两步加尾法整合为一步加尾法，使得实验操作简便，约节省之前一半时间，同时减少了开关开盖次数，降低了污染可能性；本专利技术使用的是通用探针而非特异性探
针，使得检测一个miRNA的成本降低约60%。并且对于批量检测外泌体miRNA标志物的效率提升和成本控制有非常积极的作用。
附图说明
[0021]图1为本专利技术实施例1提供的基于NGS测序结果中外泌体miRNA标志物的低成本验证方法的原理示意图。
[0022]图2为本专利技术实施例2提供的基于NG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测miRNA的引物和探针组合的设计方法，其特征在于，包括：针对待测miRNA的核苷酸序列，设计特异性长链引物RT、特异性短链引物PF、通用短链引物PR和通用探针PP；所述特异性长链引物RT包括非特异的通用序列Q1和特异性的序列Q2；所述的特异性的序列Q2为与所述待测miRNA的3
’
端起的4~8个碱基互补的特异性序列；所述的特异性短链引物PF包括保护碱基和与待测miRNA的5
’
端起始的12~18个碱基相同的序列；所述通用序列Q1包括：所述通用短链引物PR和所述通用探针PP的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的设计方法，其特征在于，所述特异性长链引物RT从5
’
至3
’
依次包括：通用性短链引物PR、通用性探针PP、11个oligo（dT）序列和所述待测miRNA的3
’
端起的4~8个碱基互补的特异性序列。3.根据权利要求1或2所述的设计方法，其特征在于，所述特异性长链引物RT的长度为50~60个碱基；所述特异性短链引物PF的长度为16~25个碱基，TM值为58
‑
62℃；所述通用短链引物PR的长度为18个碱基，TM值为58
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62℃；所述通用探针PP的长度为14个...

【专利技术属性】
技术研发人员：王程程，秦伟伟，林海军，陈静，孔关义，
申请(专利权)人：北京恩泽康泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：