一种酪氨酸酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术属于酶工程技术领域，涉及一种酪氨酸酶突变体及应用。所述的酪氨酸酶突变体在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的野生型酪氨酸酶中突变多个氨基酸位点。利用本发明专利技术的酪氨酸酶突变体及其制备茶黄素的方法，能够使得突变体较野生型酪氨酸酶具有更高的比活力，并在催化制备茶黄素时具有更高的产率。制备茶黄素时具有更高的产率。制备茶黄素时具有更高的产率。

【技术实现步骤摘要】
一种酪氨酸酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于酶工程领域，涉及一种酪氨酸酶突变体及利用其合成茶黄素的应用。

技术介绍

[0002]在中国，茶作为国饮，有着悠久的文化历史渊源。根据茶的制作和性质不同可分为红茶、绿茶、青茶、黄茶、黑茶、白茶六大茶类，而红茶作为我国的第二大茶类，生产地域较广泛，包括福建、广东、云南、台湾等十多个省份，云南和福建为其主要的种植区域。红茶区别于其它茶类最明显的特征是具有红茶、红汤、红叶、香甜味醇等特点，深受广大消费者喜爱。近年来研究表明，红茶具有许多有利健康的生理功能，如具有抑制肥胖、调血脂降血压、降血糖、抗菌抗病毒、抗癌症等功效，而这其中红茶起关键作用的是红茶中的有效功能成分——茶黄素。茶黄素最早于1957年被Roberts从红茶中提取得到，是红茶在发酵过程中形成的一类易溶于乙酸乙酯，颜色呈现橙黄色，含有苯骈卓酚酮结构的化合物(图1)，其形成机理是在红茶制备过程中，细胞内的茶多酚类物质在多酚氧化酶和过氧化物酶作用下，发生氧化反应后，自聚合形成。目前，已经发现并被分析和鉴定的茶黄素种类共有二十余种，其中最为主要的为四种(图1)，分别为：茶黄素(Theaflavin,TF1)，茶黄素
‑3‑
没食子酸酯(Theaflavin 3
‑
O
‑
gallate,TF2a)，茶黄素
‑3’‑
没食子酸酯(Theaflavin 3
’‑
O
‑
gallate,TF2b)和茶黄素双没食子酸酯(Theaflavin 3
’3‑
di
‑
O
‑
gallate,TF3)。不同种类的茶黄素是由于不同的底物儿茶酚在氧化酶的作用下，通过氧化自聚合形成。随着不同种类茶黄素结构阐明，其功能研究也日益深入，尤其是在保健和药理功能方面，研究表明茶黄素具有降血脂、抵抗衰老、抗氧化、抗癌症、预防心脑血管疾病等功能。基于此，许多茶黄素类保健品也已上市，如美国life extension公司开发了茶黄素提取物系列产品，应用于保健品等领域，随着市场不断拓展和人们对健康日益重视，茶黄素相关产品的开发在未来将具有极大的市场前景。
[0003]目前工业化生产制备茶黄素的方法主要是植物提取法和酶促氧化。采用从植物中进行分离提取方法制备茶黄素，由于茶黄素在茶叶中含量低(0.2％
‑
2％)，同时该方法存在成本高、提纯工艺较复杂、产品纯度低、收率不高等缺陷，显然不够经济，产品成本和质量也难以达到人们预期水平因此无法满足大规模工业化生产需求。
[0004]采用多酚氧化酶促氧化的方法，将植物来源(茶叶、梨等)的叶片或者其它组织细胞破碎后投入含有茶多酚的反应釜中，设置反应参数并通入氧气进行反应，利用植物中本身存在的多酚氧化酶催化茶多酚合成茶黄素，但是植物来源的茶多酚氧化酶的含量毕竟有限，同时植物组织中存在的其它成分会干扰催化反应导致后续分离纯化难度大、成本高、因此也会对茶黄素产品的质量和纯度造成影响。
[0005]目前普遍认为的涉及到茶黄素酶促合成途径中的酶为多酚氧化酶类(EC 1.10.3.1，polyphenol oxidase，PPO，)。多酚氧化酶又称为儿茶酚氧化酶，按照其底物的偏好性不同可以分为三大类，分别为儿茶酚酶(EC1.10.3.1，Catechol Oxidase)，漆酶(EC 1.10.3.2，Laccase)，酪氨酸酶(EC 1.14.18.1，Tyrosinase)。在前期的工作中，对酪氨酸酶
的研究主要集中在抗氧化以及抑制黑色素形成等医药保健和精细化工领域：如研究茶中有效成分对酪氨酸酶的抑制作用，开发美白护肤产品等。目前已商业化的酪氨酸酶，其酶源来自蘑菇等真菌微生物，对于应用酪氨酸酶氧化制备茶黄素相关研究也有报道。本专利技术首次选择巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源的酪氨酸酶基因，利用基因工程技术手段通过定向进化高通量筛选获得催化活力高、底物耐受好的突变体酶，应用于高效定向合成茶黄素或其单体具有非常重要的产业化价值和意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的首要目的是提供一种可高效合成茶黄素和其单体的酪氨酸酶突变体，该突变体较野生型的酪氨酸酶具有更高的比活力，更高的产物转化率。
[0007]为实现此目的，在基础的实施方案中，本专利技术提供一种酪氨酸酶突变体，所述的突变体在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的野生型酪氨酸酶中突变多个氨基酸位点，突变的多个氨基酸位点包括N205D，D166E,D167G,V285I中的一个或多个。
[0008]在一种优选的实施方案中，本专利技术突变体的突变方式包括以下10种中任一种：
[0009]N205D；D166E；D167G；V285I；N205D和D166E；N205D和D167G；N205D和V285I；N205D和D166E和D167G；N205D和D166E和V285I；N205D和D166E和D167G和V285I。
[0010]进一步地：突变方式包括以下7种中任一种：
[0011]N205D；N205D和D166E；N205D和D167G；N205D和V285I；N205D和D166E和D167G；N205D和D166E和V285I；N205D和D166E和D167G和V285I。
[0012]更进一步地，其中所述的突变体的氨基酸序列N205D；D166E；D167G；V285I；N205D和D166E；N205D和D167G；N205D和V285I；N205D和D166E和D167G；N205D和D166E和V285I；N205D和D166E和D167G和V285I；依次如SEQ ID NO.2
‑
11所示。
[0013]本专利技术的第二个目的是提供编码前述酪氨酸酶突变体的多核苷酸，以能够使编码的酪氨酸酶突变体较野生型酪氨酸酶具有更高的比活力，并能在催化制备茶黄素时具有更高的产物收率和更高的底物浓度耐受性。
[0014]为实现此目的，在基础的实施方案中，本专利技术提供编码前述酪氨酸酶突变体的多核苷酸。
[0015]本专利技术的第三个目的是提供所述的酪氨酸酶突变体的应用，以能够更好的制备茶黄素。
[0016]为实现此目的，在基础的实施方案中，本专利技术所述的酪氨酸酶突变体的应用是在反应体系中，用前述酪氨酸酶突变体催化儿茶素反应，制备茶黄素。
[0017]在一种优选的实施方案中，本专利技术提供所述的酪氨酸酶突变体的应用，以儿茶素类为底物，在有氧的条件下，催化合成茶黄素类产物。
[0018]儿茶素类主要底物包括：表儿茶素(epicatechin,EC)、表没食子儿茶素(epigallocatechin,EGC)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate,ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)，反应底物与合成产物如下任一种本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酪氨酸酶突变体，其特征在于：是对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行突变，突变的氨基酸位点包括N205D、D166E、D167G、V285I中的一个或多个。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于：突变方式包括以下10种中任一种：N205D；D166E；D167G；V285I；N205D和D166E；N205D和D167G；N205D和V285I；N205D和D166E和D167G；N205D和D166E和V285I；N205D和D166E和D167G和V285I。3.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于：突变方式包括以下7种中任一种：N205D；N205D和D166E；N205D和D167G；N205D和V285I；N205D和D166E和D167G；N205D和D166E和V285I；N205D和D166E和D167G和V285I。4.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于：序列依次如SEQ ID NO.2
‑
11所示。5.一种编码权利要求1
‑
4任一项所述的酪氨酸酶突变体的核苷酸。6.权利要求1
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4任一项所述的酪氨酸酶突变体的应用，其特征在于，以儿茶素类为底物，在有氧的条件下，催化合成茶黄素...

【专利技术属性】
技术研发人员：周晶辉，刘仲华，张盛，刘昌伟，赵士敏，刘亚，赵强，许岗，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：