检测血源性感染性病毒的多重荧光定量RT-PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术提供检测血源性感染性病毒的多重荧光定量RT

【技术实现步骤摘要】
检测血源性感染性病毒的多重荧光定量RT
‑
PCR试剂盒


[0001]本专利技术属生物
，涉及荧光定量RT
‑
PCR检测试剂盒，具体涉及检测血源性感染性病毒的多重荧光定量RT
‑
PCR试剂盒，是一种一步法多重实时荧光定量RT
‑
PCR在同一个反应管内检测血清标本中巨细胞病毒(CMV)、Epstein
‑
Barr病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)的核酸检测方法，可应用于血源性感染性病毒的快速筛查及血源性感染性病毒流行病学的研究。

技术介绍

[0002]过去的几十年中，人们越来越意识到感染性病原对血液安全的严重威胁，经输血传播的血源性感染性病原成为影响临床安全用血的主要关注点，而经输血传播的血源性感染性病原主要经由携带病原的献血者捐献的血液传播，因此血源性感染性病原的筛查策略是确保临床安全用血的重要措施。美国血库协会(AABB)指南显示：经输血传播的感染性病原有70余种，其中病毒(50多种)和细菌(10种)就有60多种；常见的病原包括乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV
‑
1/2)、人类嗜T淋巴细胞病毒(HTLV
‑
1/2)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类疱疹病毒8型(HHV
‑
8)、登革病毒(DENV
‑
1/2/3/4)、戊型肝炎病毒(HEV)、禽流感H7N9病毒、埃博拉病毒(EBOV)、梅毒螺旋体(TP)和疟疾等。我国实施的血液制品病原筛查包括：TP、HIV
‑
1/2、HBV和HCV四种病原。四种病原的筛查虽然能有效地保障我国及全球多数国家和地区的临床用血安全，但随着新(突)发病原和未检测到的病原的流行趋势明显增加，同时国际合作与交流日益频繁，近年来输入性血源性感染性病原不断发生，这增加了病原的传播风险，严重威胁临床安全用血，为更好地保障临床安全用血，建立符合新时代发展要求的筛查项目已迫在眉睫。
[0003]当前，我国对血液制品的病原筛查主要是对TP、HIV
‑
1/2、HBV和HCV四种病原采取ELISA和单重或三重的病原核酸检测。核酸检测技术直接，检测微量的感染性病原特异性和灵敏度高，但由于昂贵的检测费用及操作时间长等因素严重影响该技术的广泛应用。而实时荧光定量PCR技术以其全封闭检测、单管扩增实时定量、简便快捷、节约成本、重复性好等优势，并具有高特异性与敏感性，较于普通PCR检测更加优化，可作为一种血源性感染性病原筛查的快速、有效的检测手段。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供检测血源性感染性病毒的多重荧光定量RT
‑
PCR试剂盒，是一种用于血源性感染病毒(巨细胞病毒、Epstein
‑
Barr病毒、单纯疱疹病毒)检测的一步法多重荧光定量RT
‑
PCR检测试剂盒。本试剂盒包含定量RT
‑
PCR反应液、酶Mix液、引物探针Mix液、标准品(巨细胞病毒、Epstein
‑
Barr病毒、单纯疱疹病毒、RNase P)、阳性对照品(巨细胞病毒、Epstein
‑
Barr病毒、单纯疱疹病毒、RNase P)、阴性对照品。盒体设有容器孔，分别放置定量RT
‑
PCR反应液管、酶Mix液管、引物探针Mix液管、标准品管(巨细胞病毒、Epstein
‑
Barr病毒、单纯疱疹病毒、RNase P)、阳性对照品管(巨细胞病毒、Epstein
‑
Barr病毒、单纯
疱疹病毒、RNase P)、阴性对照品管。
[0005]其中定量RT
‑
PCR反应液管包含有PCR反应缓冲液管(含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物等)、酶Mix液管(含耐热TaqDNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶等)、引物探针Mix液管包含四组引物和相应的四种不同荧光标记的探针，引物探针Mix液管为棕色管。阴性对照为高温高压灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水，阳性对照为巨细胞病毒、Epstein
‑
Barr病毒、单纯疱疹病毒、RNase P的阳性质粒样品。
[0006]多重荧光定量RT
‑
PCR检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下：上游引物CMV
‑
F:5
’‑
CTGGGCATAAGCCATAATCTCATC
‑3’
下游引物CMV
‑
R:5
’‑
CAGCCTTCCCTAAGACCACC
‑3’
特异性探针CMV
‑
P:5
’‑
FAM
‑
TGCCGCCATGGCCTGACTGCAGCCA
‑
BHQ1
‑3’
上游引物EBV
‑
F:5
’‑
CCAAGAAGGTGGCCCAGAT
‑3’
下游引物EBV
‑
R:5
‑
TCCAGTGCTTGGGCCTTC
‑3’
特异性探针EBV
‑
P:5
’‑
VIC
‑
TGAGCCTGACGTGCCCCCGGGAGCG
‑
BHQ1
‑3’
上游引物HSV
‑
F:5
’‑
AGAGGGACATCCAGGACTTTG
‑3’
下游引物HSV
‑
R：5
’‑
CTTGTAATACACCGTCAGGTGG
‑3’
特异性探针HSV
‑
P:5
’‑
CY5
‑
ACCGCCGAACTGAGCAGACACCCGC
‑
BHQ3
‑3’
上游引物RNase P
‑
F:5
’‑
GATTTGGACCTGCGAGCG
‑3’
下游引物RNase P
‑
R：5
’‑
GAGCGGCTGTCTCCACAAGT
‑3’
特异性探针RNase P
‑
P:5
’‑
ROX
‑
TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG
‑
BHQ2
‑3’
。
[0007]其中巨细胞病毒、Epstein
‑
Barr病毒、单纯疱疹病毒及RNase P的特异性探针分别采用FAM、VIC、CY5和ROX四种不同荧光进行标记。
[0008]上述标准品包括巨细胞病毒、Epstein...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测血源性感染性病毒的多重荧光定量RT
‑
PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含定量RT
‑
PCR反应液、酶Mix液、引物探针Mix液、标准品、阳性对照品、阴性对照品；其中定量RT
‑
PCR反应液包含有PCR反应缓冲液、酶Mix液，引物探针Mix液包含四组引物和相应的四种不同荧光标记的探针；荧光定量RT
‑
PCR检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下：上游引物CMV
‑
F:5
’‑
CTGGGCATAAGCCATAATCTCATC
‑3’
下游引物CMV
‑
R:5
’‑
CAGCCTTCCCTAAGACCACC
‑3’
特异性探针CMV
‑
P:5
’‑
FAM
‑
TGCCGCCATGGCCTGACTGCAGCCA
‑
BHQ1
‑3’
上游引物EBV
‑
F:5
’‑
CCAAGAAGGTGGCCCAGAT
‑3’
下游引物EBV
‑
R:5
‑
TCCAGTGCTTGGGCCTTC
‑3’
特异性探针EBV
‑
P:5
’‑
VIC
‑
TGAGCCTGACGTGCCCCCGGGAGCG
‑
BHQ1
‑3’
上游引物HSV
‑
F:5
’‑
AGAGGGACATCCAGGACTTTG
‑3’
下游引物HSV
‑
R：5
’‑
CTTGTAATACACCGTCAGGTGG
‑3’
特异性探针HSV
‑
P:5
’‑
CY5
‑
ACCGCCGAACTGAGCAGACACCCGC
‑
BHQ3
‑3’
上游引物RNase P
‑
F:5
’‑
GATTTGGACCTGCGAGCG
‑3’
下游引物RNase P
‑
R：5
’...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢珏，崔大伟，徐瑜珊，林梦姣，吕燕，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：