抗PIVKA-II单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及抗PIVKA

【技术实现步骤摘要】
抗PIVKA
‑
II单克隆抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及抗PIVKA
‑
II单克隆抗体及其应用。

技术介绍

[0002]异常凝血酶原(PIVKA
‑
II)，是一种维生素K缺乏诱导蛋白。正常情况下维生素K充足，凝血酶原Gla结构域的10个谷氨酸残基(Glu)能被γ
‑
谷氨酰羧化酶氧化成γ
‑
羧基谷氨酸(Gla)，使之成为有活性的凝血酶原。当肝脏发生异常时，上述位点的一个或多个Glu残基羧化不全，从而形成PIVKA II，丧失凝血活性。因此，PIVKA
‑
II的检测对于肝脏病变至关重要。
[0003]目前已知的蛋白检测方法较多，例如：放射免疫分析法(RIA)、酶免疫分析法(EIA)、化学发光免疫法(CLEIA)等。但RIA容易受到放射性同位素的辐射影响，EIA灵敏度低、准确性不高，已逐渐被市场淘汰，相对而言，CLEIA因为其简单的操作和较高的灵敏度逐渐受到关注，成为医疗诊断行业中更佳的选择。
[0004]早期的化学发光检测PIVKA II，多采用特异性识别PIVKA II的抗体与识别凝血酶原的抗体搭配使用，但存在检测灵敏度较低的问题，为了改善灵敏度，目前多采用多克隆抗体与单克隆抗体混合使用，但多克隆抗体本身特异性不如单克隆抗体，且因为制备批次不同，容易出现批间差，导致检测精密度降低。所以，高特异性且能配对使用的单克隆抗体，会是化学发光检测PIVKA II，甚至其他采用双抗夹心检测PIVKA II方法学的更好选择，但目前市面上使用的单克隆抗体可选择性较少，且特异性不够，亟待开发更多可供选择的高特异性单克隆抗体。

技术实现思路

[0005]为了解决目前利用双抗夹心检测PIVKA II中存在的灵敏度和精密度不高的问题，本专利技术公布了高特异性的单克隆抗体，具体如下：
[0006]抗PIVKA II单克隆抗体，包括：
[0007]如SEQ ID NO：1所列的重链可变区CDR1；
[0008]如SEQ ID NO：2所列的重链可变区CDR2；
[0009]如SEQ ID NO：3所列的重链可变区CDR3；
[0010]如SEQ ID NO：4所列的轻链可变区CDR1；
[0011]如SEQ ID NO：5所列的轻链可变区CDR2；
[0012]如SEQ ID NO：6所列的轻链可变区CDR3；
[0013]上述抗PIVKA II单克隆抗体，命名为抗体D
[0014]优选的，本专利技术公开了抗PIVKA II单克隆抗体对，包括权利要求1中所述的抗体D及
[0015]如SEQ ID NO：7所列的重链可变区CDR1；
[0016]如SEQ ID NO：8所列的重链可变区CDR2；
[0017]如SEQ ID NO：9所列的重链可变区CDR3；
[0018]如SEQ ID NO：10所列的轻链可变区CDR1；
[0019]如SEQ ID NO：11所列的轻链可变区CDR2；
[0020]如SEQ ID NO：12所列的轻链可变区CDR3；
[0021]上述抗PIVKA II单克隆抗体，命名为抗体A
[0022]或
[0023]如SEQ ID NO：13所列的重链可变区CDRl；
[0024]如SEQ ID NO：14所列的重链可变区CDR2；
[0025]如SEQ ID NO：15所列的重链可变区CDR3；
[0026]如SEQ ID NO：16所列的轻链可变区CDR1；
[0027]如SEQ ID NO：17所列的轻链可变区CDR2；
[0028]如SEQ ID NO：18所列的轻链可变区CDR3；
[0029]上述抗PIVKA II单克隆抗体，命名为抗体B
[0030]或
[0031]如SEQ ID NO：19所列的重链可变区CDR1；
[0032]如SEQ ID NO：20所列的重链可变区CDR2；
[0033]如SEQ ID NO：21所列的重链可变区CDR3；
[0034]如SEQ ID NO：22所列的轻链可变区CDR1；
[0035]如SEQ ID NO：23所列的轻链可变区CDR2；
[0036]如SEQ ID NO：24所列的轻链可变区CDR3；
[0037]上述抗PIVKA II单克隆抗体，命名为抗体C。
[0038]另一方面本专利技术公开了一种抗原抗体混合物，所述抗原抗体混合物含有抗体 D。
[0039]优选的，所述抗原抗体混合物含有抗体A和抗体D、B和抗体D或C和抗体D。
[0040]上述抗体D和A、B、C的结合位点不同，通过特异性的结合PIVKAII的不同抗原结合位点配合使用，达到检测PIVKA II的目的，所述配合使用即形成抗体A
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PIVKA II
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抗体D、抗体B
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PIVKA II
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抗体D、抗体C
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PIVKA II
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抗体B，实现对PIVKA II的双抗夹心检测。
[0041]另一方面，本专利技术公开了含有上述抗体D的试剂盒。
[0042]另一方面，本专利技术公开了一种结合物，包含与化学标记或生物标记共价链接的所述抗PIVKA II单克隆抗体。
[0043]另一方面，本专利技术公开了一种偶联物，由所述抗PIVKAII单克隆抗体、和/或所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。
[0044]另一方面，本专利技术公开了所述的抗PIVKA II单克隆抗体和/或所述的结合物和/ 或所述的偶联物在制备检测PIVKA II表达产品中的应用。
[0045]技术效果：
[0046](1)本专利技术的单克隆抗体应用到化学发光试剂盒中，检测线性范围较广，在 5
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35000mAu/ml范围内可有良好区分。
[0047](2)特异性较高，制备工艺简单，成本较低。
附图说明
[0048]图1：重组蛋白纯度凝胶实验；
[0049]图2：试剂盒标准曲线；
[0050]图3：相关性实验。
具体实施例
[0051]实施例1：重组蛋白PIVKAII的表达纯化
[0052]将人PIVKA II前1
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155aa基因序列克隆至原核表达载体构建原核表达质粒，该表达质粒转化大肠杆菌BL21后用含有抗生素的LB平板培养。挑取单克隆接种至LB培养基。培养至菌液OD值达到0.6后，加入IPTG诱导蛋白的表达。诱导16小时之后离心收集菌液。菌体经破碎以后离心收集上清，并采用亲和层析以及分子筛纯化得到抗原蛋白。纯化结果如图1所示，蛋白分子量约20kDa，纯度90％以上。
[0053]实施例2：鼠免疫及抗体检测<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗PIVKA II单克隆抗体，其特征在于，包括：如SEQ ID NO：1所列的重链可变区CDR1；如SEQ ID NO：2所列的重链可变区CDR2；如SEQ ID NO：3所列的重链可变区CDR3；如SEQ ID NO：4所列的轻链可变区CDR1；如SEQ ID NO：5所列的轻链可变区CDR2；如SEQ ID NO：6所列的轻链可变区CDR3；上述抗PIVKA II单克隆抗体，命名为抗体D。2.抗PIVKA II单克隆抗体对，其特征在于，包括权利要求1中所述的抗体D及如SEQ ID NO：7所列的重链可变区CDR1；如SEQ ID NO：8所列的重链可变区CDR2；如SEQ ID NO：9所列的重链可变区CDR3；如SEQ ID NO：10所列的轻链可变区CDR1；如SEQ ID NO：11所列的轻链可变区CDR2；如SEQ ID NO：12所列的轻链可变区CDR3；上述抗PIVKA II单克隆抗体，命名为抗体A或如SEQ ID NO：13所列的重链可变区CDR1；如SEQ ID NO：14所列的重链可变区CDR2；如SEQ ID NO：15所列的重链可变区CDR3；如SEQ ID NO：16所列的轻链可变区CDR1；如SEQ ID NO：...

【专利技术属性】
技术研发人员：易维京，赵忠灏，边颖，蔡方琴，张丽华，
申请(专利权)人：重庆中元汇吉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：