文昌鱼C型凝集素BjCTL4基因及其应用制造技术

本申请属于生物领域，提供了文昌鱼C型凝集素BjCTL4基因及其应用。本申请首次发现的C型凝集素BjCTL4基因编码的蛋白，其CTL样结构域具有传统CTL的基本特征，包括两对或者三对保守的二硫键，特征性基序WIGL的类似基序，以及与Ca

【技术实现步骤摘要】
文昌鱼C型凝集素BjCTL4基因及其应用


[0001]本申请属于生物领域，具体涉及文昌鱼C型凝集素BjCTL4基因及其应用。

技术介绍

[0002]文昌鱼(代表性的例子如：青岛文昌鱼(Branchiostoma japonicum))，属于脊索动物门(Chordate)，头索动物亚门(cephalochordate)，是现存和脊椎动物亲缘关系最近的无脊椎动物。文昌鱼缺乏类似脊椎动物的适应性免疫系统，但仍然能在充满病原微生物的海洋环境中健康生存，主要依赖于其有效而特异的免疫系统。先天免疫系统的诱导性防御机制是由一系列的模式识别分子(PRR)识别病原相关分子模式(PAMP)，并起始各种信号途径控制一系列免疫相关基因的表达从而达到清除病原体的效果。
[0003]C型凝集素(C type lectin,CTL)超家族是一类包含C
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type lectin like domains(CTLDs)且功能广泛的蛋白。利用凝集素分子通过模式识别效应来区分“自己”和“非己”也已经成为无脊椎动物和脊椎动物参与先天免疫的重要手段。
[0004]关于人类和其它哺乳动物CTL家族的免疫功能研究已经积累了大量资料，并且随着对高等动物CTL家族在天然免疫中重要性的认识，人们意识到低等动物，如鱼类、昆虫、甲壳动物、软体动物和线虫等，其CTL分子在先天免疫中也是占据非常重要的地位。
[0005]文昌鱼和脊椎动物CTL分子的同源性相差较大，但令人惊讶的是脊椎动物几类CTL蛋白都能在文昌鱼中找到同源物，如SEEC、DGCR2、polycystin和collectin等，并且dualCTLD类CTL蛋白也存在于文昌鱼中。对文昌鱼CTL家族的初步功能分析显示，它们功能广泛，但多数是作为一种急性免疫反应蛋白参与对机体的防御。其中由N端信号肽和单个CTLD组成的CTL分子AmphiCTL1具有细菌识别和凝集的活性，可以作为PRR参与文昌鱼先天免疫反应，并且与其它CTL分子功能不同的是，它还具有直接杀伤特异微生物的活性，其活性的发挥主要通过结合微生物细胞壁上的肽聚糖和葡聚糖完成的(Yu et al.,2007)。
[0006]文昌鱼是现存的最原始的脊索动物代表，其基因组水平、形体结构和免疫机制都代表了最简单的脊椎动物模式，是研究脊椎动物免疫系统的起源和进化的理想实验动物模型。结合低等动物CTL家族的多样性和复杂性，对文昌鱼的CTL进行深入的研究，从而研究文昌鱼的免疫防御机制和对病原感染应答的规律，能够为阐明海水养殖动物免疫防御机制提供资料，为开发海水养殖控制病害提供新方法、新思路，也为养殖水产动物病害的免疫防治技术提供理论依据。

技术实现思路

[0007]一方面，本申请提供了一种多肽，所述多肽的序列如SEQ ID NO：4所示。
[0008]一方面，本申请提供了一种包含SEQ ID NO：4所述序列的多肽；在一些实施方案中，所述多肽的序列如SEQ ID NO.：3所示。
[0009]一方面，本申请提供了一种核酸，其编码所述的多肽；在一些实施方案中，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO：2所示；在一些实施方案中，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO：
1所示。
[0010]一方面，本申请提供了所述多肽的表达方法，包括以下步骤：
[0011]S1.构建载有所述的核酸的重组表达载体；
[0012]S2.将步骤S1制备的重组表达载体转化宿主细胞；
[0013]S3.对步骤S2制备的转化后的宿主细胞进行培养；
[0014]S4.对步骤S3培养后的宿主细胞进行多肽的提取和纯化
[0015]在一些实施方案中，所述步骤S1包括以下步骤：
[0016]S1.1根据所述的核酸的序列设计引物；
[0017]S1.2以含有所述的核酸序列的pGEX
‑
T easy vector质粒为模板，以S1.1的引物进行PCR扩增；
[0018]S1.3将步骤S1.2的PCR扩增产物克隆到表达载体上，得到重组表达载体。
[0019]在一些实施方案中，所述引物的选自SEQ ID NO.：5和SEQ ID NO.：6所示的引物，或SEQ ID NO.：7和SEQ ID NO.：8所示的引物；
[0020]在一些实施方案中，所述引物含有Kpn I和/或Xho I切割位点。
[0021]在一些实施方案中，所述步骤S4中蛋白的纯化选自亲和层析法；在一些实施方案中，所述亲和层析法选自Ni
2+
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Chelating Sepharose Fast Flow。
[0022]一方面，本申请提供了一种载体，其包含所述的核酸分子。
[0023]在一些实施方案中，所述载体选自质粒、噬菌体、人工染色体、病毒中的至少一种；在一些实施方案中，所述载体选自质粒；优选地，所述载体选自pET23a
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ELP
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GFP或pET
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SUMO。
[0024]一方面，本申请提供了一种细胞，其包含所述的核酸或所述的载体。
[0025]在一些实施方案中，所述细胞选自原核细胞；在一些实施方案中，所述细胞选自大肠杆菌；在一些实施方案中，所述大肠杆菌选自BL21(DE3)菌株。
[0026]一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含任一所述的多肽，或所述的核酸，或所述的载体，所述的细胞；以及任选地，药学上可接受的载体和/或赋形剂。
[0027]一方面，本申请提供了任一所述的多肽，或所述多肽任一的融合蛋白，或所述的核酸，或所述的载体，或所述的细胞，或所述的药物组合物在制备抗感染性疾病药物中的应用。
[0028]在一些实施方案中，所述融合蛋白选自SUMO融合蛋白或ELP融合蛋白中的一种或两种；在一些实施方案中，所述融合蛋白选自SUMO融合蛋白。
[0029]在一些实施方案中，所述感染性疾病选自细菌引起的感染；在一些实施方案中，所述细菌选自肺炎克雷伯氏菌、粪肠球菌、巴氏葡萄球菌、大肠杆菌和贝内克氏菌中的至少一种。
[0030]本申请首次发现的C型凝集素BjCTL4基因编码的蛋白，其CTL样结构域具有传统CTL的基本特征，包括两对或者三对保守的二硫键，特征性基序WIGL的类似基序，以及与Ca
2+
相关的糖结合基序QPD/EPN和WND的类似基序，经过验证能较为广泛结合细菌表面的多糖，并且有明显的细菌结合、细菌凝集作用，可发展为天然的抑菌活性物质以及制备治疗感染性疾病的药物。
附图说明
[0031]图1为实施例2中文昌鱼BjCTL4与人的代表性CTLs的Alignment比对结果。
[0032]图2为实施例3中文昌鱼BjCTL4蛋白结构预测分析结果。
[0033]图3为实施例4中SUMO基因的PCR扩增结果。其中，M为DL2000 marker，1为SUMO。
[0034]图4为实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多肽，其特征在于，所述多肽的序列如SEQ ID NO：4所示。2.一种包含如权利要求1所述序列的多肽；优选地，所述多肽的序列如SEQ ID NO.：3所示。3.一种核酸，其编码如权利要求1或2任一所述的多肽；优选地，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO：2所示；优选地，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO：1所示。4.如权利要求1或2所述的多肽的表达方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.构建载有如权利要求3所述的核酸的重组表达载体；S2.将步骤S1制备的重组表达载体转化宿主细胞；S3.对步骤S2制备的转化后的宿主细胞进行培养；S4.对步骤S3培养后的宿主细胞进行多肽的提取和纯化。5.如权利要求4所述的表达方法，其特征在于，所述步骤S1包括以下步骤：S1.1根据如权利要求3所述的核酸的序列设计引物；S1.2以含有如权利要求3所述的核酸序列的pGEX
‑
T easy vector质粒为模板，以S1.1的引物进行PCR扩增；S1.3将步骤S1.2的PCR扩增产物克隆到表达载体上，得到重组表达载体；优选地，所述引物的选自SEQ ID NO.：5和SEQ ID NO.：6所示的引物，或SEQ ID NO.：7和SEQ ID NO.：8所示的引物；优选地，所述引物含有Kpn I和/或Xho I切割位点；优选地，所述步骤S4中蛋白的纯化选自亲和层析法；优选地，所述亲和层析法选自Ni
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【专利技术属性】
技术研发人员：黄慧清，黄盛丰，徐安龙，严信宇，李军，徐立群，杨满意，徐单单，陈素红，王霞，
申请(专利权)人：广东食品药品职业学院，
类型：发明
国别省市：