一种新冠病毒SARS-CoV-2广谱多肽抗原及其特异性中和抗体和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种新冠病毒SARS

【技术实现步骤摘要】
一种新冠病毒SARS
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CoV
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2广谱多肽抗原及其特异性中和抗体和应用


[0001]本专利技术属于病毒免疫检测
，具体涉及一种新冠病毒SARS
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CoV
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2广谱多肽抗原及其特异性中和抗体和应用。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒SARS
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CoV
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2是一种传染性极强的病毒。SARS
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CoV
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2的S蛋白包含两个亚基：S1和S2。S1亚基通过其RBD与细胞受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合，而S2亚基通过融合肽(FP)介导病毒与细胞膜的融合。由于S2在感染过程中的融合过程中的重要作用，可以作为广泛保护的靶点。目前，SARS
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CoV
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2逃逸突变体的频繁出现，给当下针对具有免疫优势的受体结合域(RBD)新冠疫苗策略带来了挑战。
[0003]然而，目前尚无针对SARS
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CoV
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2S2的广谱疫苗及检测抗S2抗体的快速检测方法。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种SARS
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CoV
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2广谱多肽抗原，所述抗原在SARS
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CoV
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2原型株以及众多流行突变株中均无突变，可特异性识别新冠病毒SARS
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CoV
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2的抗体，具有较好的抗原性。
[0005]本专利技术提供了一种新冠病毒SARS
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CoV
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2广谱多肽抗原，所述广谱多肽抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0006]本专利技术提供了一种三重新冠病毒SARS
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CoV
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2广谱多肽串联融合蛋白，所述融合蛋白包括3条所述新冠病毒SARS
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CoV
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2广谱多肽抗原的序列串联排列。
[0007]优选的，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0008]本专利技术提供了所述三重新冠病毒SARS
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CoV
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2广谱多肽串联融合蛋白的构建方法，包括以下步骤：
[0009]1)以pCold I质粒为模板，用核苷酸序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的引物对进行PCR扩增，得到线性化pCold I表达载体；
[0010]2)以pcDNA3.1
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SARS
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CoV
‑2‑
S质粒为模板，用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对进行PCR扩增第一片段，用SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:3所示的引物对进行PCR扩增第二片段，用SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物对进行PCR扩增第三片段；
[0011]3)利用重组酶对步骤1)中所述线性化pColdⅠ表达载体、步骤2)中所述第一片段、第二片段和第三片段进行快速重组克隆，得到重组质粒；
[0012]4)将步骤3)中所述重组质粒转化细胞，经培养、IPTG诱导得到融合蛋白。
[0013]优选的，步骤2)中所述PCR扩增的反应程序为94℃变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环；最后72℃延伸10min；
[0014]所述PCR扩增的反应体系为33μl水，10μl 5倍缓冲液，1μl 10mM dNTP，2μl 10μmol上游引物，2μl 10μmol下游引物，1μl 10ng/μl的pColdⅠ质粒或pcDNA3.1
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SARS
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CoV
‑2‑
S质
的PCR产物；泳道M，DNAMarker；
[0026]图4为用SDS
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PAGE分析SARS
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CoV
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2三重广谱多肽串联融合蛋白的表达结果，其中泳道1，pColdⅠ超声裂解沉淀；泳道2，His
‑3×
P4超声裂解沉淀；泳道3，pColdⅠ超声裂解上清；泳道4，His
‑3×
P4超声裂解上清；泳道5，纯化的His
‑3×
P4蛋白；泳道M，蛋白Marker；
[0027]图5为用Western blot鉴定SARS
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CoV
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2三重广谱多肽串联融合蛋白的表达结果，其中泳道1，pColdⅠ超声裂解沉淀；泳道2，pColdⅠ超声裂解上清；泳道3，His
‑3×
P4超声裂解上清；泳道4，His
‑3×
P4超声裂解沉淀；泳道M，蛋白Marker；
[0028]图6为包被多肽抗原的ELISA检测抗三重广谱多肽串联融合蛋白小鼠血清；
[0029]图7为间接免疫荧光鉴定抗三重广谱多肽串联融合蛋白小鼠血清与SARS
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CoV
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2S蛋白反应性；
[0030]图8为SARS
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CoV
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2假病毒中和试验鉴定抗三重广谱多肽串联融合蛋白小鼠血清的中和活性。
具体实施方式
[0031]本专利技术提供了一种新冠病毒SARS
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CoV
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2广谱多肽抗原，所述广谱多肽抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1(DPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDIS)所示。所述多肽抗原在SARS
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CoV2原型株以及各流行突变株中均无突变，且在其他冠状病毒(SARS
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CoV和BatCoV RaTG13)中均具有相同序列。并且通过与SARS
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CoV
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2人阳性血清的反应，确定了该多肽抗原的特异性。因此，基于所述多肽抗原可建立了简单快捷的ELISA方法特异性检测SARS
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CoV
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2抗体(S2抗体)的方法。
[0032]本专利技术提供了一种三重新冠病毒SARS
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CoV
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2广谱多肽串联融合蛋白，所述融合蛋白包括3条所述新冠病毒SARS
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CoV
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2广谱多肽抗原的序列串联排列。所述融合蛋白优选在所述新冠病毒SARS
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CoV
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2广谱多肽抗原之间还有连接肽。本专利技术对所述连接肽的氨基酸序列没有特殊限制，采用本领域所熟知的连接肽的氨基酸序列即可。在本专利技术实施例中，所述连接肽为GGGGS(SEQ ID NO:9)。所述融合蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:8所示。所述融合蛋白的5
’
端包含组氨酸标签，便于后续分离纯化。所述融合蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新冠病毒SARS
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CoV
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2广谱多肽抗原，其特征在于，所述广谱多肽抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.一种三重新冠病毒SARS
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CoV
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2广谱多肽串联融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括3条权利要求1所述新冠病毒SARS
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CoV
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2广谱多肽抗原的序列串联排列。3.根据权利要求2所述三重新冠病毒SARS
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CoV
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2广谱多肽串联融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。4.权利要求2或3所述三重新冠病毒SARS
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CoV
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2广谱多肽串联融合蛋白的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)以pColdI质粒为模板，用核苷酸序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的引物对进行PCR扩增，得到线性化pCold I表达载体；2)以pcDNA3.1
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SARS
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CoV
‑2‑
S质粒为模板，用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对进行PCR扩增第一片段，用SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:3所示的引物对进行PCR扩增第二片段，用SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物对进行PCR扩增第三片段；3)利用重组酶对步骤1)中所述线性化pColdⅠ表达载体、步骤2)中所述第一片段、第二片段和第三片段进行快速重组克隆，得到重组质粒；4)将步骤3)中所述重组质粒转化细胞，经培养、IPTG诱导得到融合蛋白。5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤2)中所述PCR扩增的反应程序为94℃变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环；最后72℃延伸10min；所述PCR扩增的反应体系为33μl水，10μl 5倍缓冲液，1μl 10mM dNTP，2μl 10μmol上游引物，2μl 10μmol下游引物，1μl 10...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶建强，李拓凡，阚秋琪，秦爱建，万志敏，邵红霞，谢泉，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：