一种BMP7基因缺失外周血间充质干细胞的建立方法技术

本发明专利技术涉及一种BMP7基因缺失外周血间充质干细胞的建立方法，具体步骤包括：1)根据BMP7基因序列，设计sgRNA序列；2)sgRNA活性检测，确定最优sgRNA，最优sgRNA序列为GGCGAGTGAGGAGGCGGGCG；3)将步骤2)中切割效率最高的sgRNA和嘌呤霉素抗性的PGK

【技术实现步骤摘要】
一种BMP7基因缺失外周血间充质干细胞的建立方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种BMP7基因缺失外周血间充质干细胞的建立方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)属于成体干细胞的一种，主要来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有自我更新、自我增殖和多向分化的能力，可分化为软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、神经细胞、施万细胞等，存在于外周血、骨髓、脐带血、皮肤、胎盘、羊水、牙髓等，其中骨髓组织中的含量最为丰富，外周血间充质干细胞(peripheral blood
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derived mesenchymal stem cells,PBMSCs)相对于骨髓间充质干细胞具有以下优点：1.来源更加广泛；2.取材更加方便，临床上可操作性强；3.取材过程中减少组织损伤，降低局部组织感染的风险；4.降低医疗成本，减轻患者经济负担。
[0003]骨形成因子蛋白可以诱导骨形成，在组织胚胎发育、细胞的生长、分化、迁移凋亡中具有关键作用。骨形成因子7(BMP7)是TGF
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β超家族的一员，其具有重要的生物学功能，不仅促进骨的再生，而且对肾脏高糖损伤和纤维化具有重要的保护功能，其在动物发育调控和器官生成、乳腺和前列腺肿瘤的发生发展等过程中起着重要的调控功能。
[0004]将外周血充质干细胞的BMP7基因缺失，可以抑制其向成骨细胞分化，利用此模型，可以筛选促成骨形成药物，也可以研究BMP7的信号通路。
专利技术内容
[0005]本专利技术的目的是建立BMP7基因缺失的外周血间充质干细胞；
[0006]本专利技术提供一种基因打靶试剂盒，所述试剂盒包括两条Oligo序列，其序列为ACACCGGCGAGTGAGGAGGCGGGCGG(Seq ID No.1)AAAACCGCCCGCCTCCTCACTCGCCG(Seq ID No.2)，使用该试剂盒可以用于BMP7基因表达的沉默。
[0007]进一步的，本专利技术提供一种BMP7基因缺失外周血间充质干细胞的建立方法，所述方法包括：
[0008]1.采集、冻存、传代外周血干细胞；
[0009]2.构建BMP7基因敲除外周血干细胞
[0010]2.1根据BMP7基因序列，设计sgRNA序列；
[0011]在NCBI上查询人BMP7基因序列(NM_001719，Seq ID No.3)，根据CRISPR/Cas9敲除原理，在http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx上设计BMP7靶位点；
[0012]2.2sgRNA活性检测，确定最优sgRNA；
[0013]根据sgRNA订购oligo1和oligo2；oligo1和oligo2退火形成寡核苷酸双链；将寡核苷酸双链连接到pX330载体上；再将连接产物转化至E coli DH5α感受态细胞中，在37℃的含氨苄抗性平板过夜生长，之后挑取单克隆至含氨苄抗性的LB培养基中，于37℃摇床过夜扩大培养，之后按照Tiangen小提质粒试剂盒的说明书提取质粒，最后将质粒测序；为检测
sgRNA的切割效率，采用lipo3000脂质体转染法，将之前构建好的sgRNA与Cas9共表达的91个载体分别转染至293T细胞中，每6
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8h换液，细胞转染36h后收集细胞，提取细胞总mRNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，用设计好的引物进行PCR，PrimerF:TTGGAAGAGGGTGGGTTG(Seq ID No.4)，PrimerR:TGTCTGAG TCAAGATGGAGA(Seq ID No.5)，PCR条件如下：2
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Phanta Max Buffer 25μL，Phanta Max Super
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Fidelity DNA Polymerase 1μL，dNTP Mix 1μL，PrimersF 2μL，PrimersR 2μL，cDNA 1μL，加ddH2O补至50μL，PCR程序如下：98℃预变形3min；(98℃变性15s；65℃退火15s；72℃延伸1min，2
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4步共35个循环)；72℃延伸5min；PCR产物大小3449bp，将PCR产物跑胶后按照Magen胶回收试剂盒说明书进行回收，得到回收产物，取800ng回收产物，2μL 10
×
NEB bufferⅡ，加ddH2O补至20μL，梯度退火：95℃，10min；95℃至85℃Ramp：2.0℃/s；85℃至25℃Ramp 0.2℃/s；16℃forever；向退火后的产物中加0.5μL T7核酸内切酶Ⅰ，37℃水浴30min，之后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，通过是否有切开后的相对小的两条目的条带以及被切开的条带所占的比例选择切割效率最高的sgRNA；
[0014]2.3将步骤2.2中切割效率最高的sgRNA载体和嘌呤霉素抗性的PGK
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puro质粒电转到外周血间充质干细胞；
[0015]待外周血间充质干细胞密度为70％
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80％时，按照Lonza电转说明书，将sgRNA78和嘌呤霉素抗性的PGK
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puro质粒共转染到外周血间充质干细胞中，待转染48h后，将细胞传代至10cm细胞培养皿培养，待细胞贴壁后加入嘌呤霉素(1μg/mL)进行筛选3d，经过2周的培养后挑选细胞克隆，并扩大培养；
[0016]3.基因敲除验证；
[0017]取BMP7基因敲除的外周血间充质干细胞，提取mRNA，反转录为cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增引物、体系、程序同步骤2，将PCR产物跑胶后按照Magen胶回收试剂盒说明书进行回收，得到回收产物，取800ng回收产物，2μL 10
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NEB bufferⅡ，加ddH2O补至20μL，梯度退火：95℃，10min；95℃至85℃Ramp：2.0℃/s；85℃至25℃Ramp 0.2℃/s；16℃forever；向退火后的产物中加0.5μL T7核酸内切酶Ⅰ，37℃水浴30min，之后用2％琼脂糖凝胶电泳检测；
[0018]4.将基因敲除细胞进行测序；
[0019]将PCR鉴定已敲除的细胞，提取mRNA，反转录为cDNA，交生物公司测序。
[0020]本专利技术的有益效果和优点在于：
[0021]本专利技术提供一种BMP7基因缺失外周血间充质干细胞的建立方法，可用于筛选促成骨形成药物。
附图说明
[0022]图1：外周血间充质干细胞
[0023]图2：基因敲除验证
[0024]图3：基因敲除序列与野生型序列比对
[0025]图4：外周血间充质干细胞向骨细胞分化
具体实施方式
[0026]下面通过实施例对本专利技术做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本专利技术，并...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种BMP7基因缺失外周血间充质干细胞的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：1)采集、冻存、传代外周血干细胞；2)根据BMP7基因序列，设计sgRNA序列；3)sgRNA活性检测，确定最优sgRNA，最优sgRNA序列为GGCGAGTGAGGAGGCGGGCG，具体步骤包括：a.将寡核苷酸双链连接到pX330载体上，再将连接产物转化至E coli DH5α感受态细胞中，扩大培养，提取质粒；b.将之前构建好的sgRNA与Cas9共表达的91个载体分别转染至293T细胞中；c.提取步骤b细胞的mRNA，反转录为cDNA，用设计好的引物进行PCR；d.酶切步骤c中的PCR产物；e.通过是否有切开后的相对小的两条目的条带以及被切开的条带所占的比例选择切割效率最高的sgRNA；4)将步骤3)中切割效率最高的sgRNA和嘌呤霉素抗性的PGK
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puro质粒电转到外周血间充质干细胞；5)基因敲除验证；6)将基因敲除细胞进行测序。2.根据权利要求1所述的一种BMP7基因缺失外周血间充质干细胞的建立方法，其特征在于，步骤3)中所述PCR引物序列为PrimerF:TTGGAAGAGGGTGGGTTG，Prime r...

【专利技术属性】
技术研发人员：原福贞，余家阔，杨梦，叶景，许冰冰，陈有荣，
申请(专利权)人：北京大学第三医院北京大学第三临床医学院，
类型：发明
国别省市：