一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法技术

本发明专利技术提供了一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法。该技术方案首先确定了Merkel细胞多瘤病毒的一种特异性标志物，即大T抗原基因LTag；在此基础上，以其为检测对象进行荧光定量PCR扩增。基于LTag良好的特异性以及qPCR的高效性，实现了对Merkel细胞多瘤病毒的快速、灵敏检测。此外，本发明专利技术利用LTag全基因序列和pTA22质粒构建重组质粒，经核酸定量和纯度检测后可作为标准品用于绘制标准曲线，从而作为本发明专利技术检测方法的定量依据。实验验证表明，本发明专利技术具有良好的特异性和灵敏性，而且操作简便、检测快速，可用于临床病例的快速筛查诊断。诊断。诊断。

【技术实现步骤摘要】
一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，进一步涉及荧光定量PCR技术，具体涉及一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法。

技术介绍

[0002]Merkel细胞癌(Merkel cell carcinoma，MCC)是一种罕见的皮肤神经内分泌肿瘤，有较高的复发率和转移率。有统计表明，北半球地区近80％的MCC病例是由Merkel细胞多瘤病毒(Merkel cell polyomavirus，MCV)引起的，因此对Merkel细胞多瘤病毒的检测在临床上具有重要意义。然而，目前缺乏快捷灵敏的检测试剂，使得疾病难以确诊且容易延误治疗。

技术实现思路

[0003]本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法，以解决目前，尚未确定Merkel细胞多瘤病毒的特异性标志物的技术问题。
[0004]本专利技术要解决的另一技术问题是，如何提供一种Merkel细胞多瘤病毒的灵敏、快速的检测方法。
[0005]为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法，该方法以Merkel细胞多瘤病毒的大T抗原基因LTag为检测对象。
[0007]作为优选，该方法采用的PCR引物为：
[0008]正向引物5
’‑
TTGTCTCGCCAGCATTGTAG
‑3’
；
[0009]反向引物5
’‑
ATATAGGGGCCTCGTCAACC
‑3’
。
[0010]作为优选，该方法以待测样品为模板，以序列为5
’‑
TTGTCTCGCCAGCATTGTAG
‑3’
和5
’‑
ATATAGGGGCCTCGTCAACC
‑3’
的DNA片段为正向引物和反向引物，执行荧光定量PCR扩增。
[0011]作为优选，在所述执行荧光定量PCR扩增之前，先以标准品为模板，以序列为5
’‑
TTGTCTCGCCAGCATTGTAG
‑3’
和5
’‑
ATATAGGGGCCTCGTCAACC
‑3’
的DNA片段为正向引物和反向引物，执行荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线。
[0012]作为优选，所述标准品是由以下方法制备的：人工合成两端分别含有BamHI和XbaI限制性内切酶位点的MCV LTag全基因序列，克隆至pTA22质粒，得到pTA22
‑
MCV质粒，对质粒DNA进行核酸定量和纯度检测，再进行稀释，得到若干已知浓度的标准品。
[0013]作为优选，所述荧光定量PCR扩增的反应体系为：DNA模板2μL，正向引物和反向引物混合物2.5μL、2
×
Thunderbird SYBR qPCR Mix 10μL、ddH2O 3μL。
[0014]作为优选，所述荧光定量PCR扩增的反应程序为：95℃1min变性；95℃15s，60℃1min进行荧光信号收集，45个循环。
[0015]本专利技术提供了一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法。该技术方案首先确定了Merkel细胞多瘤病毒的一种特异性标志物，即大T抗原基因LTag；在此基础上，以其
为检测对象进行荧光定量PCR扩增。基于LTag良好的特异性以及qPCR的高效性，实现了对Merkel细胞多瘤病毒的快速、灵敏检测。此外，本专利技术利用LTag全基因序列和pTA22质粒构建重组质粒，经核酸定量和纯度检测后可作为标准品用于绘制标准曲线，从而作为本专利技术检测方法的定量依据。实验验证表明，本专利技术具有良好的特异性和灵敏性，而且操作简便、检测快速，可用于临床病例的快速筛查诊断。
附图说明
[0016]图1是本专利技术具体实施方式中的荧光定量PCR曲线图。
[0017]图2是本专利技术具体实施方式中基于CT值的标准曲线图。
[0018]图3是本专利技术具体实施方式中的交叉扩增曲线图(a)以及扩增后产物的电泳图(b)；图a中，MCV、BKV、JCV、TSV分别是由各自特异性引物扩增的曲线；图b中，M为marker，Neg为阴性对照组，MCV、BKV、JCV、TSV分别为对应的扩增产物条带。
[0019]图4是本专利技术具体实施方式中部分HIV/AIDS患者血清/血浆MCV DNA的扩增曲线图。
具体实施方式
[0020]以下将对本专利技术的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本专利技术所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
[0021]一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法：
[0022]1)基因合成MCV(GenBank序列号：FJ464337)LTag全基因序列(bp)，两端分别含有BamHI和XbaI限制性内切酶位点，该基因通过基因克隆方法克隆至pTA22质粒，命名为pTA22
‑
MCV。
[0023]2)克隆后对质粒DNA进行核酸定量和纯度检测，质粒原始浓度为1.4
×
108copies/μL，通过10倍梯度稀释至14copies/μL并构建荧光定量PCR DNA模板。
[0024]3)以该含LTag基因的不同浓度质粒为模板，对LTag基因采用的引物为：正向引物5
’‑
TTGTCTCGCCAGCATTGTAG
‑3’
；反向引物5
’‑
ATATAGGGGCCTCGTCAACC
‑3’
；通过Syber Green荧光定量PCR扩增出LTag基因。
[0025]4)荧光定量PCR：PCR反应20μL体系如下：DNA模板2μL、正向引物和反向引物混合2.5μL、2
×
Thunderbird SYBR qPCR Mix 10μL、ddH2O 3μL；体系构建后，在伯乐CFX 96荧光定量PCR仪上进行扩增，流程为：95℃1min变性；95℃15s，60℃1min(荧光信号收集)，45个循环。PCR结束后，各浓度模板对应的荧光曲线如图1所示，从图谱结果可以看出10倍梯度稀释的DNA模板的结果呈现规律的变化(CT值升高)，检出下限为1.4
×
101拷贝数，灵敏度高。
[0026]5)绘制标准曲线：根据梯度稀释的DNA浓度和CT值绘制标准曲线如图2所示，R2达0.9989，DNA浓度和对应的CT值呈良好的线性关系。
[0027]特异性验证：
[0028]进一步验证该方法的特异性，对另外三种常见的人多瘤病毒BK本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，该方法以Merkel细胞多瘤病毒的大T抗原基因LTag为检测对象。2.根据权利要求1所述的一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，该方法采用的PCR引物为：正向引物5
’‑
TTGTCTCGCCAGCATTGTAG
‑3’
；反向引物5
’‑
ATATAGGGGCCTCGTCAACC
‑3’
。3.根据权利要求1所述的一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，该方法以待测样品为模板，以序列为5
’‑
TTGTCTCGCCAGCATTGTAG
‑3’
和5
’‑
ATATAGGGGCCTCGTCAACC
‑3’
的DNA片段为正向引物和反向引物，执行荧光定量PCR扩增。4.根据权利要求3所述的一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，在所述执行荧光定量PCR扩增之前，先以标准品为模板，以序列为5
’‑
TTGTCTCGCCAGCATTGTA...

【专利技术属性】
技术研发人员：周显凤，
申请(专利权)人：南昌市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：