一种利用环境DNA技术检测鱼类物种多样性的方法技术

本发明专利技术提出了一种利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，涉及分子生态学技术领域。该利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其包括如下步骤：采集待测地的水样，过滤后提取eDNA，得到待检测水样eDNA，利用引物组进行PCR扩增，得到扩增产物，将扩增产物进行高通量测序，得到序列片段，将所述序列片段拼接后进行OTU聚类分析物种多样性；所述引物组包括上游引物和下游引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQID.NO 1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQID.NO 2所示。本发明专利技术的优点在于，该方法可用于检测鱼类物种多样性，尤其是湖泊水生生物多样性，并且检测结果精准，可检出的种类多。可检出的种类多。可检出的种类多。

【技术实现步骤摘要】
一种利用环境DNA技术检测鱼类物种多样性的方法


[0001]本专利技术涉及分子生态学
，具体而言，涉及一种利用环境DNA 技术检测鱼类物种多样性。

技术介绍

[0002]环境DNA(environmentalDNA，eDNA)于20世纪70年代末被首次 提出，是指从有机体脱落释放出来的游离的DNA分子，存在于土壤、沉积 物、空气和水体等环境中。环境DNA提取技术最早被用于分离和纯化沉积 物中微生物的DNA。近年来，环境DNA技术被应用于生物多样性分析、 生物量估测、珍稀物种发现、生物入侵物种的监控以及群落系统发育重建 等生态学研究领域。通过环境DNA技术，可以在提取DNA片段后利用测 序技术进行定性或定量分析环境中的物种种类和物种生物量。
[0003]传统的湖泊生物多样性的研究主要有捕捞法和声学探测法。捕捞法是 通过对水体中的鱼类进行捕捞，捕捞存在作业强度高、成本高、准确性低 以及破坏鱼类资源等问题。声学探测法受限于水域理化指标和天气状况， 而且无法实现大面积调查。为了解决传统方法中存在的技术问题，人们开 始考虑使用环境DNA技术监测水体中鱼类的物种多样性。如“用于鱼类群 落结构研究的环境DNA鉴定方法”(CN201510005835.0)，其包括如下步 骤，步骤(1)：根据鱼类群落所在水域的大小，采集水样；步骤(2)：将所述 的水样进行处理后，提取其中的总环境DNA；步骤(3)：将所述的总环境 DNA采用核苷酸序列为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的16S rDNA序列作为 通用引物进行PCR扩增，得到PCR产物；步骤(4)：将所述的PCR产物进 行凝胶电泳，得到带有DNA的凝胶；步骤(5)：将所述的带有DNA的凝胶 进行切胶克隆测序后通过GENBANK进行blast比对，以确定所述的DNA 是否为鱼类序列；步骤(6)：确定所述的DNA为鱼类序列后，采用二代测序 技术对所述的PCR产物的组成情况进行大规模分析，以确定环境中DNA 的鱼类群落组成及分布，可以在一个PCR样品中获得几千乃至上万条16S rDNA条带，有利于统计和增加研究的精确性，同时降低了固定样品数下样 品采集的成本。然而这种鉴定方法还存在一些缺陷，比如检测精度不够， 结果准确率有待提高。针对这一技术问题，“一种基于环境DNA技术检测 鱼类物种多样性的方法”(CN201910216942.6)，其包括如下步骤：(1) 取待测水域的表层水样；(2)将所取的水样进行处理，提取eDNA；(3) 以提取的eDNA为模板，CytbF(序列如SEQIDNO:1)和CytbR(序列如 SEQIDNO:2)、16SF(序列如SEQIDNO:3)和16SR(序列如SEQIDNO:4) 为引物，PCR扩增，得到PCR产物；(4)回收、纯化目的片段，构建目 的片段文库，进行高通量测序后的原始数据优化后获得高质量序列；(5) OTU聚类：应用软件Vsearch2.3.4对高质量序列在97％的相似性水平上进 行聚类，产生可操作性分类单元(operationaltaxonomicunits，OTUs)；(6) 建立鱼类本地比对数据库；(7)OTUs代表性序列与建立的鱼类数据库的 数据信息进行比对分析，确定待测水域中鱼类的物种多样性组成。该专利 可以在保证检测精度的基础上，检测到21～38种鱼类。然而，该方法的检 测量还存在一定的问题，无法在相同检测时间内监测到更多的物种。
[0004]因此，需要研发一种检测精度高，检测量大的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种利用环境DNA技术检测鱼类物种多样性 的方法，此方法通过采用如SEQID.NO 1和SEQID.NO 2所示的引物组检测 水体鱼类多样性，检出率高，检出量大。
[0006]本专利技术解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
[0007]本申请实施例提供一种利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，包 括如下步骤：采集待测地的水样，过滤后提取eDNA，得到待检测水样 eDNA，利用引物组进行PCR扩增，得到扩增产物，将扩增产物进行高通 量测序，得到序列片段，将所述序列片段拼接后进行OTU聚类分析物种多 样性；所述引物组包括上游引物和下游引物，所述正向引物的核苷酸序列 如SEQID.NO1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQID.NO 2所示。
[0008]相对于现有技术，本专利技术的实施例至少具有如下优点或有益效果：
[0009]本专利技术实施例的提供的利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，通 过前期摸索出最为适宜的采样方法，过滤方法，eDNA提取方法，PCR条 件和体系，排除了采样误差、eDNA体系内杂质对于检测结果的影响，同时 摸索出的PCR条件和体系，有利于排除引物组对于检测结果的影响，最终 形成的整体方法可用于检测鱼类物种多样性，尤其是湖泊水生生物多样性， 并且检测结果精准，可检出的种类多。
附图说明
[0010]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需 要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些 实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0011]图1为本专利技术实施例2的采样点信息图；
[0012]图2为本专利技术实施例2中检测出的eDNA种类分布图。
具体实施方式
[0013]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发 明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件 者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产 厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0014]需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的 特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本专利技术。
[0015]本申请实施例提供一种利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其 包括如下步骤：采集待测地的水样，过滤后提取eDNA，得到待检测水样 eDNA，利用引物组进行PCR扩增，得到扩增产物，将扩增产物进行测序， 得到序列片段，将所述序列片段拼接后进行OTU聚类分析物种多样性；所 述引物组包括上游引物和下游引物，所述正向引物的核苷酸序列如 SEQID.NO 1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQID.NO 2所示。通过 采用如SEQID.NO 1
和SEQID.NO 2所示的引物组检测水体鱼类多样性，检 出率高，检出量大。
[0016]在本专利技术的一些实施例中，上述利用环境DNA检测鱼类物种多样性的 方法，所述过滤包括如下步骤，将所述水样在采集后24h内使用混合纤维 素脂膜进行真空处理，抽滤完后将所述混合纤维素脂膜立即保存于
‑
20℃或 进行后续步骤。工业废水、生活污水和其他废弃物进入江河湖海等水体， 超过水体自净能力会导致水体的物理、化学、生物等方面特征的改变，从 而影响到水的利用价值，危害人体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，包括如下步骤：采集待测地的水样，过滤后提取eDNA，得到待检测水样eDNA，利用引物组进行PCR扩增，得到扩增产物，将扩增产物进行测序，得到序列片段，将所述序列片段拼接后进行OTU聚类分析物种多样性；所述引物组包括上游引物和下游引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQID.NO 1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQID.NO 2所示。2.根据权利要求1所述的环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，所述过滤包括如下步骤，将所述水样在采集后避光保存并在24h内使用混合纤维素脂膜进行真空过滤处理，抽滤完后将所述混合纤维素脂膜放置2mL离心管中并立即保存于
‑
20℃或进行后续步骤。3.根据权利要求1所述的环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，所述混合纤维素脂膜的孔径为0.45μm。4.根据权利要求1所述的环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，所述正向引物和反向引物的5
’
端均添加有核苷酸序列如SEQID.NO3所示的标签。5.根据权利要求1所述的环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性10min；55个循环包括94℃变性30s，54℃退火30s，延伸72℃延伸1min；72℃最后延伸5min。6.根据权利要求5所述的环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，PCR扩增的反应体系为每25μL体系中包括：2*PCR Mastermix 12.5μL，DMSO 1μL，Dnase I 0.5μL，BSA 0.25μL，正向...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢迎春，赵亚辉，高婉茹，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院，
类型：发明
国别省市：