【技术实现步骤摘要】
对用于序列操纵的改进的系统、方法和酶组合物进行的工程化和优化
[0001]本申请是申请日为2013年12月12日、申请号为201380072821.X、专利技术名称 为“对用于序列操纵的改进的系统、方法和酶组合物进行的工程化和优化”的专利技术 专利申请的分案申请。
[0002]相关应用和引用参考
[0003]本申请要求于2013年6月17日提交的标题为用于序列操纵的系统、方法和酶 组合物的工程化和优化(ENGINEERING AND OPTIMIZATION OF IMPROVEDSYSTEMS,METHODS AND ENZYME COMPOSITIONS FOR SEQUENCEMANIPULATION)的美国临时专利申请61/836,101的优先权。本申请还要求美国 临时专利申请61/758,468;61/769,046;61/802,174;61/806,375;61/814,263; 61/819,803以及61/828,130的优先权,每个的标题为对用于序列操纵的系统、方法 以及组合物进行的工程化和优化,分别提交于2013年1月30日;2013年2月25 日;2013年3月15日;2013年3月28日;2013年4月20日;2013年5月6日 以及2013年5月28日。本申请还要求分别于2012年12月12日和2013年1月2 日提交的标题均为“用于序列操纵的系统、方法和组合物(SYSTEMS METHODSAND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION)”的美国临时专利申 请61/7 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种工程化的、非天然存在的CRISPR
‑
Cas系统,其包括:(a)Cas9蛋白或编码所述Cas9蛋白的多核苷酸;(b)CRISPR
‑
Cas系统嵌合RNA,其包含能够与真核细胞的核中与原型间隔子邻近基序(PAM)相邻的靶序列杂交并引导CRISPR
‑
Cas复合物与所述靶序列来序列特异性结合的指导序列,能够与tracr序列杂交的tracr配对序列,和tracr序列。2.一种工程化的、非天然存在的CRISPR
‑
Cas系统,其包括:(a)Cas9蛋白或编码所述Cas9蛋白的多核苷酸;(b)CRISPR
‑
Cas系统crRNA,其包含能够与真核细胞的核中与原型间隔子邻近基序(PAM)相邻的靶序列杂交并引导CRISPR
‑
Cas复合物与所述靶序列来序列特异性结合的指导序列和能够与tracr序列杂交的tracr配对序列;和(c)包含tracr序列的tracrRNA。3.一种工程化的、非天然存在的CRISPR
‑
Cas载体系统,其包括一个或多个载体,所述载体包含:(a)编码Cas9蛋白的多核苷酸;(b)编码CRISPR
‑
Cas系统嵌合RNA的多核苷酸,其中所述嵌合RNA包含能够与真核细胞的核中与原型间隔子邻近基序(PAM)相邻的靶序列杂交并引导CRISPR
‑
Cas复合物与所述靶序列来序列特异性结合的指导序列,能够与tracr序列杂交的tracr配对序列,和tracr序列。4.一种工程化的、非天然存在的CRISPR
‑
Cas载体系统,其包括一个或多个载体,所述载体包含:(a)编码Cas9蛋白的多核苷酸;(b)编码CRISPR
‑
Cas系统crRNA的多核苷酸,其中所述crRNA包含能够与真核细胞的核中与原型间隔子邻近基序(PAM)相邻的靶序列杂交并引导CRISPR
‑
Cas复合物与所述靶序列来序列特异性结合的指导序列,能够与tracr序列杂交的tracr配对序列;和(c)编码tracrRNA的多核苷酸,其中所述tracrRNA包含tracr序列。5.根据权利要求1、2、3或4所述的系统,其中所述Cas9蛋白是选自棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、黄杆菌属、Sphaerochaeta、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟菌属、罗氏菌属、细小棒菌属、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属或弯曲杆菌属的属的Cas9直向同源物。6.根据权利要求1、2、3或4所述的系统,其中所述Cas9蛋白选自:沃兹沃思萨特氏菌Cas9、龈沟产线菌Cas9、约氏乳杆菌Cas9、红嘴鸥弯曲杆菌Cas9、白喉棒状杆菌Cas9、食清洁剂细小棒菌Cas9、鸡毒支原体Cas9、金黄色葡萄球菌Cas9、巴黎嗜肺军团菌Cas9、齿垢密螺旋体Cas9、伪中间型葡萄球菌Cas9、或灰色奈瑟菌Cas9。7.根据权利要求1、2、3或4所述的系统,其中所述Cas9蛋白的长度为500
‑
1000个氨基酸。8.根据权利要求1、2、3或4所述的系统,其中所述tracr序列的长度为至少30个核苷酸。9.根据权利要求1、2、3或4所述的系统,其中所述tracr序列的长度为至少40个核苷酸。10.根据权利要求1、2、3或4所述的系统,其中所述tracr序列的长度为至少50个核苷
酸。11.根据权利要求1、2、3或4所述的系统,其中所述指导序列的长度为15
‑
30个核苷酸。12.根据权利要求1、2、3或4所述的系统,其中所述Cas9蛋白是能够切割两条DNA链的核酸酶。13.根据权利要求1、2、3或4所述的系统,其中所述Cas9蛋白的至少一个催化结构域被突变,使得所述Cas9蛋白是缺乏切割一条DNA链的能力的切口酶。14.根据权利要求13所述的系统,其中所述Cas9蛋白包含对应于化脓链球菌Cas9的D10A,H840A,N854A或N863A的突变。15.根据权利要求1、2、3或4所述的系统,其中所述Cas9蛋白的至少两个催化结构域被突变,使得所述Cas9蛋白基本上缺乏DNA切割活性。16.根据权利要求15所述的系统,其中所述Cas9蛋白包含对应于化脓链球菌Cas9的D10A的突变和对应于化脓链球菌Cas9的H840A,N854A或N863A的突变。17.根据权利要求1、2、3或4所述的系统,其中所述Cas9蛋白是金黄色葡萄球菌Cas9。18.根据权利要求1、2、3或4所述的系统,其中所述Cas9蛋白与至少一个核定位信号(NLS)连接。19.根据权利要求1、2、3或4所述的系统,其中所述Cas9蛋白与至少两个NLS连接。20.根据权利要求1、2、3或4所述的系统,其中所述Cas9蛋白与至少一个N末端NLS和至少一个C末端NLS连接。21.根据权利要求1、2、3或4所述的系统,其中所述Cas9蛋白与至少一个异源蛋白质结构域连接。22.根据权利要求21所述的系统,其中所述异源蛋白质结构域具有以下活性中的一种或多种:甲基酶活性、脱甲基酶活性、转录激活活性、转录阻抑活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。23.根据权利要求1、2、3或4所述的系统,其中编码所述Cas9蛋白的所述多核苷酸被密码子优化以在哺乳动物细胞或人细胞中表达。24.根据权利要求1或2所述的系统,其中所述系统包括编码所述Cas9蛋白的mRNA。25.根据权利要求3或4所述的系统,其中所述一个或多个载体是病毒载体,任选地其中组分(a)和(b)位于同一载体上。26.根据权利要求25所述的系统,其中所述一个或多个载体是腺相关病毒(AAV)载体。27.根据权利要求1、2、3或4所述的系统在制造用于基因疗法的药物中的用途。28.根据权利要求1、2、3或4所述的系统用于离体或体外修饰真核细胞的用途。29.一种真核细胞,其包含根据权利要求1、2、3或4所述的系统。30.一种非人类生物,其包含权利要求29所述的真核细胞,其中所述非人类生物不是动物或植物品种。31.一种用于产生修饰的真核细胞的离体或体外方法,其包括将工程化的、非天然存在的CRISPR
‑
Cas系统引入真核细胞,所述系统包括:(a)Cas9蛋白或编码所述Cas9蛋白的多核苷酸;(b)CRISPR
‑
Cas系统嵌合RNA,其包含能够与真核细胞的核中与原型间隔子邻近基序(PAM)相邻的靶序列杂交并引导CRISPR
‑
Cas复合物与所述靶序列来序列特异性结合的指导
序列,能够与tracr序列杂交的tracr配对序列,和tracr序列,从而获得修饰的真核细胞...
【专利技术属性】
技术研发人员:F,
申请(专利权)人:麻省理工学院哈佛大学校长及研究员协会,
类型:发明
国别省市:
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。