重组鼠李糖脂生产菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及应用微生物和基因工程技术领域，特别是涉及一株重组鼠李糖脂生产菌及其利用该菌株发酵产鼠李糖脂发酵的应用。本发明专利技术方法将来自于粪透明颤菌(Vitreoscilla stercoraria)的血红蛋白基因vgb连接到表达载体上构建重组载体PBBR1MCS

【技术实现步骤摘要】
重组鼠李糖脂生产菌及其应用


[0001]本专利技术涉及应用微生物和基因工程
，特别是涉及一株重组鼠李糖脂生产菌及其利用该菌株发酵产鼠李糖脂发酵的应用。

技术介绍

[0002]鼠李糖脂(rhamnolipids)是一种由微生物合成的次级代谢产物，属于糖脂类生物表面活性剂。鼠李糖脂作为生物表面活性剂具有优异的的表/界面活性以及发泡、乳化、破乳、去污、增溶、鳌合金属、极端环境下稳定性好，相比目前大量使用的化学合成表面活性剂，鼠李糖脂毒性低，环境友好，易降解，在石油开采、污染治理、农业、工业、食品等领域都具有广泛的应用前景。
[0003]目前，鼠李糖脂的应用问题在于较低的产量和较高的发酵成本导致其市场价格远远高于廉价的化学合成表面活性剂，从而限制了鼠李糖脂的规模化应用。因此，提高鼠李糖脂产量，降低发酵过程的能耗，都有助于降低发酵成本，利于鼠李糖脂的市场化应用。
[0004]专性好氧的透明颤菌(Vitreoscilla)能够在贫氧的条件下生存，是因为其细胞内表达一种血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHb)，该蛋白能够提高细胞对氧气的利用能力。VHb在多种异源宿主细胞表达后，对细胞生长和产物合成有积极的促进作用，因此，可以通过引入血红蛋白来提高发酵产物产量和降低发酵过程中的所需通气量，另外，较低的温度条件会扩大血红蛋白对菌株生长和产物合成的这种积极的作用。因此，血红蛋白可以在一定程度上有效在降低鼠李糖脂发酵成本。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供了一株重组鼠李糖脂生产菌及其构建方法和利用该菌株发酵产鼠李糖脂发酵的应用。粪透明颤菌(Vitreoscilla stercoraria)的血红蛋白VHb。
[0006]为实现上述目的，本专利技术中所采用的技术方案为：
[0007]一种重组鼠李糖脂生产菌，重组菌株含透明颤菌属粪透明颤菌的血红蛋白基因的重组质粒。
[0008]所述宿主菌株为铜绿假单胞菌。
[0009]所述透明颤菌属粪透明颤菌的血红蛋白基因的重组质粒为将粪透明颤菌的完整血红蛋白基因vgb，连接到表达载体pBBR1MCS
‑
5上，构建表达血红蛋白的质粒pBBR1MCS
‑5‑
vgb。
[0010]通过氯化钙热激法将所述重组质粒转化至铜绿假单胞菌，抗性筛选得到表达血红蛋白的产鼠李糖脂重组菌。
[0011]一种重组鼠李糖脂生产菌的应用，所述重组鼠李糖脂生产菌在促进鼠李糖脂的合成中的应用。
[0012]所述重组菌株于种子液中在30～37℃，150～180rpm下培养16～24小时；而后将种子液按3～5％的接种量接种至发酵培养基中在26～38℃，100～200rpm，培养5～7天。
[0013]所述种子液培养基按重量百分比计，酵母粉0.5
‑
1.2％，蛋白胨1
‑
2.4％，氯化钠1
‑
2％，余量为水；
[0014]所述发酵培养基按重量百分比计，丙三醇3
‑
5％，大豆油1
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1.5％，硝酸盐0.3
‑
0.4％，磷酸盐1.5
‑
1.8％，氯化钠0.1
‑
0.15％，氯化钾0.1
‑
0.2％，镁盐0.07
‑
0.09％，钙盐0.01
‑
0.03％，硫酸锰0.01
‑
0.02％，硫酸锌0.2
‑
0.28％，余量为水，PH6.7～7.0。
[0015]所述硝酸盐为硝酸钠和/或硝酸钾；镁盐为氯化镁和/或硫酸镁；钙盐为碳酸钙和/或硫酸钙；磷酸盐为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的一种或几种。
[0016]本专利技术中的有益效果：
[0017]本专利技术利用基因工程技术获得重组铜绿假单胞菌表达血红蛋白，利用所得重组菌株进行培养提高重组菌的氧气利用率，进而提高鼠李糖脂产量，降低了发酵所需搅拌量和温度，极大程度地降低了鼠李糖脂的发酵生产成本，有益于鼠李糖脂的规模化和市场化应用。
附图说明
[0018]图1为本专利技术实施例提供的pBBR1MCS
‑5‑
vgb结构图。
[0019]图2为本专利技术实施例提供的载体pBBR1MCS
‑5‑
vgb导入铜绿假单胞菌PCR验证电泳图。
[0020]图3为本专利技术实施例提供的鼠李糖脂标准曲线。
具体实施方式
[0021]以下结合实例对本专利技术的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本专利技术，并不局限于本专利技术。
[0022]下述实施例中所用的材料如无特殊说明均可从商业途径得到。
[0023]实施例1：表达血红蛋白的质粒pBBR1MCS
‑5‑
vgb的构建
[0024]利用引物vgb
‑
f：CGCGGATCCGGAAGACCCTCATGTTAGA，vgb
‑
r：ATTATCTAGATTATTCAACCGCTTGAGCGTA，从粪透明颤菌(ATCC 15218)中通过PCR获得完整的vgb基因片段，并将该片段连接到克隆载体pMD19
‑
T，得到重组载体pMD19
‑
T
‑
vgb。
[0025]利用BamHⅠ和SalⅠ双酶切质粒pBBR1MCS
‑
5和pMD19
‑
T
‑
vgb，酶切后利用试剂盒回收PBBR1MCS
‑
5酶切后的大片段，pMD19
‑
T
‑
vgb切胶回收vgb片段，将回收两片段经T4连接酶连接，即得到重组质粒pBBR1MCS
‑5‑
vgb(参见图1)。
[0026]实施例2：表达血红蛋白铜绿假单胞菌工程菌的构建
[0027]将实施例1的重组质粒pBBR1MCS
‑5‑
vgb应用氯化钙热激法转化铜绿假单胞菌感受态，涂布含50μg/mL庆大霉毒的LB固体平板，37℃恒温培养直至长出转化子，经过PCR验证，获得表达VHb的铜绿假单胞菌工程菌。具体方法如下：
[0028](1)将铜绿假单胞菌接种于5mL的LB液体培养基中活化培养，培养条件为37℃，180rpm。(2)接种环蘸取活化的菌液于LB平板划线，37℃培养过夜。(3)挑取长出的单菌落接种LB液体培养基中,37℃，180rpm条件下培养。(4)将上述获得培养液以1:100(v/v)的比例转接于新鲜的LB液体培养基中，培养2～3h至OD
600
＝0.5左右。(5)将上述培养液转入50mL离心管，冰上放置20min。(6)而后以4℃，3000r/min离心10min后弃上清液。(7)向上述收集的
沉淀中加5mL预冷的0.1mo本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组鼠李糖脂生产菌，其特征在于：重组菌株含透明颤菌属粪透明颤菌的血红蛋白基因的重组质粒。2.按权利要求1所述的重组鼠李糖脂生产菌，其特征在于：所述宿主菌株为铜绿假单胞菌。3.按权利要求1或2所述的重组鼠李糖脂生产菌，其特征在于：所述透明颤菌属粪透明颤菌的血红蛋白基因的重组质粒为将粪透明颤菌的完整血红蛋白基因vgb，连接到表达载体pBBR1MCS
‑
5上，构建表达血红蛋白的质粒pBBR1MCS
‑5‑
vgb。4.按权利要求3所述的重组鼠李糖脂生产菌，其特征在于：通过氯化钙热激法将所述重组质粒转化至铜绿假单胞菌，抗性筛选得到表达血红蛋白的产鼠李糖脂重组菌。5.一种权利要求1所述的重组鼠李糖脂生产菌的应用，其特征在于：所述重组鼠李糖脂生产菌在促进鼠李糖脂的合成中的应用。6.按权利要求5所述的重组鼠李糖脂生产菌的应用，其特征在于：所述重组菌株于种子液中在30～37℃，150～180rpm下培养16～24小时；而后将种子液按3～5％的接种量接种至发酵培养基中在26～38℃，100～200rpm，培养5～7天。7.按权利要求5所述的重组鼠李糖脂生产菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：张颖，雷丽莹，韩斯琴，史荣久，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，
类型：发明
国别省市：