使用SNP谱分析对少量血液样品中的外源DNA进行定量制造技术

本文提供了用于经由少量血液样品的SNP谱分析对外源无细胞DNA(cfDNA)进行定量的方法。所述方法允许通过分析利用指尖采血针或其他装置非侵入性收集的少量患者毛细血管血样来监测器官移植排斥的状态。所述方法还允许指导免疫抑制剂的剂量并允许在即将发生器官衰竭的情况下为新的器官移植做准备。的情况下为新的器官移植做准备。的情况下为新的器官移植做准备。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用SNP谱分析对少量血液样品中的外源DNA进行定量
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2018年12月5日提交的美国临时申请号62/775,673的优先权权益，该申请的全部内容通过引用并入本文。
[0003]关于联邦政府赞助的研究的声明
[0004]本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的政府拨款号R01 HG008752的支持下完成的。政府对这项专利技术享有一定的权利。
[0005]背景


[0006]本专利技术总体上涉及分子生物学和基因型谱分析的领域。更特别地，它涉及用于使用SNP谱分析对少量血液样品中的外源DNA进行定量的方法。
[0007]相关技术说明
[0008]器官受体接受免疫抑制剂以降低接受非自身(同种异体)器官移植后的排斥可能性。器官排斥的标准诊断性测试是活检。与传统的侵入性活检相比，非侵入性检查更安全，且允许更频繁地监测移植器官的状态。然而，早期器官移植排斥的非侵入性生物标志物是有限的。尿液中的肌酐是用于评估肾脏排斥反应的黄金标准，但只有在肾脏发生严重损伤后，肌酐水平才会升高。正在研究特定类型的器官/组织移植的其他生物标志物，包括肾脏的mRNA(Suthanthiran等人，2013)、胰岛和肾脏的外泌体(Vallabhajosvula等人，2017；Park等人，2017)。无细胞DNA(cfDNA)中供体来源的单核苷酸多态性(SNP)可作为器官移植排斥的通用非侵入性生物标志物。尽管开发了由少于267个SNP组成的SNP组以用于监测移植受体中的免疫抑制疗法(美国专利Appln.Publn.号2016/0145682)，但由于需要从血浆中分离cfDNA，则至少需要1mL血浆样品。需要监测移植受体的新方法。

技术实现思路

[0009]因此，本文提供了通过对来自器官移植受体的少量的指尖血样(小于200μL)的单核苷酸多态性(SNP)进行谱分析来检测和监测器官移植排斥的方法。本文还提供了用于从总DNA中选择性扩增cfDNA的方法、用于使用cfDNA的片段化位点作为分子条形码的方法、以及使用专用的杂交捕获探针组对SNP进行谱分析的方法、以及对供体来源的cfDNA分数进行定量的方法。
[0010]在一个实施例中，本文提供了对包含长DNA片段和短DNA片段两者的DNA样品中的短DNA片段进行选择性扩增的方法，该方法包括：(a)将通用衔接子寡核苷酸连接到长DNA片段和短DNA片段的每个末端，从而生成衔接子修饰的长DNA片段和短DNA片段，(b)通过执行延长时间为介于约1秒与约15秒之间(诸如例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15秒)的PCR并使用与通用衔接子杂交的寡核苷酸引物来选择性扩增衔接子修饰的短DNA片段，从而生成扩增的短DNA片段，以及(c)执行大小选择以分离扩增的短DNA片段。大小选择可以包含凝胶电泳纯化或基于珠粒的纯化。可以使用Ampure XP珠粒、凝胶纯化或电泳执行
大小选择。
[0011]在一些方面，短DNA片段的长度介于约50个核苷酸与400个核苷酸之间，诸如例如，约50
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375个核苷酸、约50
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350个核苷酸、约50
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325个核苷酸、约50
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300个核苷酸、约50
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275个核苷酸、约50
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250个核苷酸、约50
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225个核苷酸、约50
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200个核苷酸、约75
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400个核苷酸、约75
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375个核苷酸、约75
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350个核苷酸、约75
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325个核苷酸、约75
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300个核苷酸、约75
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275个核苷酸、约75
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250个核苷酸、约75
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225个核苷酸、约100
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400个核苷酸、约100
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375个核苷酸、约100
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350个核苷酸、约100
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325个核苷酸、约100
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300个核苷酸、约100
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275个核苷酸、约100
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250个核苷酸、约150
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400个核苷酸、约150
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375个核苷酸、约150
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350个核苷酸、约150
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325个核苷酸、约150
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300个核苷酸、约200
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400个核苷酸、约200
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375个核苷酸、约200
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350个核苷酸，或其中可推导出的任何范围。在一些方面，短DNA片段的平均大小可为约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400个核苷酸或其中可推导出的任何值。
[0012]在一些方面，步骤(b)中的PCR以介于约1秒与约30秒之间的退火时间执行，诸如例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30秒。在一些方面，DNA样品包含无细胞DNA(cfDNA)。在一些方面，短DNA片段包含cfDNA。在一些方面，DNA样品包含从全血中提取的DNA。在一些方面，DNA样品是从口腔拭子或尿液中提取的。
[0013]在一些方面，在步骤(a)之前，对长DNA片段和短DNA片段进行末端修复。在一些方面，在步骤(b)之前，将衔接子修饰的长DNA片段和短DNA片段进行柱纯化。在一些方面，通用衔接子包含从5
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到3
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的与寡核苷酸引物互补的区域以及与寡核苷酸引物不互补的区域。在一些方面，步骤(c)的大小选择包含凝胶纯化。在一些方面，该方法进一步包括(d)：对扩增的短DNA片段进行测序。
[0014]在一些方面，步骤(d)中的测序是下一代测序。在某些方面，下一代测序为双末端测序或单读测序。在某些方面，该方法进一步包括(e)：通过(1)将序列与参考基因组比对以确定扩增子长度以及(2)去除扩增子长度大于400个核苷酸的任何序列来富集扩增的短DNA片段序列。
[0015]在一个实施例中，本文提供了分析DNA样品中单核苷酸多态性(SNP)的方法，该方法包括：(a)将DNA样品与杂交捕获探针的混合物杂交，其中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或所有的杂交捕获探针独立地对应于基因组区域，该基因组区域具有群体次要等位基因频率大于25％的SNP，其中每个基因组区域：(1)在基因组中出现不超过10次；(2)具有介于约0.25与约0.75之间的GC含量；以及(3)不含有任何长度超过4个核苷酸的单个碱基串，从而生成捕获探针结合的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种对包含长DNA片段和短DNA片段两者的DNA样品中的短DNA片段进行选择性扩增的方法，所述方法包括：(a)将通用衔接子寡核苷酸连接到所述长DNA片段和所述短DNA片段的每个末端，从而生成衔接子修饰的长DNA片段和衔接子修饰的短DNA片段，(b)通过以介于约1秒与约15秒之间的延伸时间执行PCR并使用与所述通用衔接子杂交的寡核苷酸引物来选择性扩增所述衔接子修饰的短DNA片段，从而生成扩增的短DNA片段，以及(c)执行大小选择以分离所述扩增的短DNA片段。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述短DNA片段具有介于约50个核苷酸与400个核苷酸之间的长度。3.根据权利要求1
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2所述的方法，其中步骤(b)中的所述PCR以介于约1秒与约30秒之间的退火时间来执行。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中所述DNA样品包含无细胞DNA(cfDNA)。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述短DNA片段包含无细胞DNA(cfDNA)。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中所述DNA样品包含从全血中提取的DNA。7.根据权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中所述DNA样品是从口腔拭子或尿液中提取的。8.根据权利要求1
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7中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前，对所述长DNA片段和所述短DNA片段进行末端修复。9.根据权利要求1
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8中任一项所述的方法，其中在步骤(b)之前，对所述衔接子修饰的长DNA片段和所述衔接子修饰的短DNA片段进行柱纯化。10.根据权利要求1
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9中任一项所述的方法，其中所述通用衔接子从5
’
到3
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包含与所述寡核苷酸引物互补的区域以及不与所述寡核苷酸引物互补的区域。11.根据权利要求1
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10中任一项所述的方法，其中步骤(c)的所述大小选择包括凝胶电泳纯化或基于珠粒的纯化。12.根据权利要求1
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11中任一项所述的方法，其进一步包括(d)对所述扩增的短DNA片段进行测序。13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(d)中的所述测序为下一代测序。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述下一代测序为双末端测序或单读测序。15.根据权利要求14所述的方法，其进一步包括(e)通过(1)将所述序列与参考基因组比对以确定扩增子长度以及(2)去除扩增子长度大于400个核苷酸的任何序列来富集所述扩增的短DNA片段序列。16.一种分析DNA样品中单核苷酸多态性(SNP)的方法，所述方法包括(a)将所述DNA样品与杂交捕获探针的混合物杂交，其中至少80％的所述杂交捕获探针独立地对应于基因组区域，所述基因组区域具有群体次要等位基因频率大于25％的SNP，其中每个基因组区域：(1)在所述基因组中出现不超过10次；(2)具有介于约0.25与约0.75之间的GC含量；以及(3)不含有任何长度超过4个核苷酸的单碱基串，
从而生成捕获探针结合的DNA；(b)分离杂交捕获探针结合的DNA；(c)将通用衔接子寡核苷酸连接到所述杂交捕获探针结合的DNA的每个末端；(d)使用与所述衔接子序列杂交的引物来扩增所述杂交捕获探针结合的DNA，从而生成扩增的DNA；以及(e)对所述扩增的DNA进行测序。17.根据权利要求16所述的方法，其中每个基因组区域包含围绕所述SNP的80个核苷酸。18.根据权利要求17所述的方法，其中每个基因组区域在所述基因组中是唯一的。19.根据权利要求16
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18中任一项所述的方法，其中所述方法分析介于约500个与约1,000,000个之间的SNP。20.根据权利要求16
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19中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前对所述DNA样品进行扩增，从而生成扩增的双链DNA样品。21.根据权利要求20所述的方法，其中根据权利要求1
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15中任一项所述的方法对所述DNA样品进行扩增。22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述扩增的DNA样品包含具有长度介于约50个核苷酸与约400个核苷酸之间的DNA片段。23.根据权利要求20所述的方法，其中在步骤(a)之前将所述扩增的双链DNA样品变性，从而生成扩增的单链DNA样品。24.根据权利要求23所述的方法，其中通过在至少80℃的温度对所述扩增的双链DNA样品加热至少2分钟来使所述扩增的双链DNA样品变性。25.根据权利要求23所述的方法，其中所述扩增的双链DNA样品通过化学变性而变性。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述化学变性包括将所述扩增的双链DNA样品与氢氧化钠一起温育。27.根据权利要求23所述的方法，其中所述扩增的双链DNA样品通过酶促变性而变性。28.根据权利要求16
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27中任一项所述的方法，其中步骤(d)中的所述测序为下一代测序。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述下一代测序为双末端测序。30.根据权利要求28所述的方法，其中所述下一代测序为单读测序。31.根据权利要求16
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30中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述分离包括所述杂交捕获探针结合的DNA的固相捕获。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述杂交捕获探针结合的DNA的所述固相捕获包括将所述杂交捕获探针结...

【专利技术属性】
技术研发人员：大卫，
申请(专利权)人：威廉马歇莱思大学，
类型：发明
国别省市：