一种纳豆激酶活性的检测方法技术

本发明专利技术提出了一种纳豆激酶活性的检测方法，属于化学分析技术领域，包括以下步骤：S1.纤维蛋白平板的制备；S2.待测样品溶液的制备；S3.尿激酶标准曲线的测定；S4.尿激酶标准曲线的绘制；S5.待测样品纳豆激酶活性的测定。本发明专利技术根据回归方程计算样品中尿激酶活性大小。样品中的纳豆激酶以尿激酶活性大小IU计，表示纳豆激酶活性，方法简单，准确率高。准确率高。准确率高。

【技术实现步骤摘要】
一种纳豆激酶活性的检测方法


[0001]本专利技术涉及化学分析
，具体涉及一种纳豆激酶活性的检测方法。

技术介绍

[0002]纳豆激酶(NK)是纳豆中的一种碱性丝氨酸蛋白酶，具有较强纤溶活性，因此常食纳豆可减少血管栓塞的危险，有益于老年性心血管疾病的预防。
[0003]纳豆激酶的活性反映了纳豆的保健功效，纳豆中的纳豆激酶是直接分解血栓的纤维蛋白酶，具有强大的溶栓作用，比尿激酶的能力还要强，每克湿纳豆溶栓效果相当于尿激酶1600FU，在胃肠中不失活。纳豆激酶对血栓1的作用时间长，与尿激酶3
‑
5分钟作用时间相比，纳豆激酶作用长达8小时，而且安全、无副作用，
[0004]因此纳豆激酶活性测定的研究是所有纳豆纤溶活性研究的基础，是纳豆研究和质量控制中关键的技术之一，对纳豆生产企业具有指导意义。
[0005]纳豆激酶活性测定方法常见的有琼脂糖
‑
纤维蛋白平板法、纤维蛋白块溶解时间法、四肽底物法、酶联免疫吸附法和血清板法等。传统的琼脂糖
‑
纤维蛋白平板法实验操作复杂，实验过程耗时，难以进行大批量样品高通量筛选。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提出一种纳豆激酶活性的检测方法，根据回归方程计算样品中尿激酶活性大小。样品中的纳豆激酶以尿激酶活性大小IU计，表示纳豆激酶活性，方法简单，准确率高。
[0007]本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0008]本专利技术提供一种纳豆激酶活性的检测方法，包括以下步骤：
[0009]S1.纤维蛋白平板的制备：将Tirs
‑
HCl溶液溶解琼脂后，加入NaCl混合加热至60
‑
80℃溶解，冷却至50℃时加入纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液，混合均匀后倾入灭菌平皿中，室温放置30
‑
40min，以形成纤维蛋白凝块；
[0010]S2.待测样品溶液的制备：取待测样品，加NaCl溶液溶解，并稀释成标准曲线范围内的浓度；
[0011]S3.尿激酶标准曲线的测定：用打孔器或注射器在纤维蛋白平板上打孔，并做好标识；取等体积各浓度的标准尿激酶溶液到对应的孔中，放置10
‑
20min后置于35
‑
37℃恒温培养箱中反应，16
‑
20h后取出测定各溶解圈的垂直两直径；
[0012]S4.尿激酶标准曲线的绘制：用垂直直径的乘积(S)的常用对数为横坐标，标准尿激酶浓度的常用对数为纵坐标，制作尿激酶酶活标准曲线；
[0013]S5.待测样品纳豆激酶活性的测定：取待测样品上样于同一平皿的孔中，放置10min后置于37℃恒温培养箱中反应，18h后测量溶解圈的垂直两直径，根据标准曲线方法及稀释浓度求出样品的纳豆激酶活性。
[0014]作为本专利技术的进一步改进，步骤S1中所述Tirs
‑
HCl溶液的pH值为7.5
‑
8.5。
[0015]作为本专利技术的进一步改进，步骤S1中所述琼脂、NaCl的质量比为5：(5
‑
6)。
[0016]作为本专利技术的进一步改进，步骤S1中所述纤维蛋白原溶液的浓度为40
‑
60mg/mL；所述凝血酶溶液浓度为80
‑
120U/mL。
[0017]作为本专利技术的进一步改进，步骤S1中所述纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液的体积比为10：(0.5
‑
1.5)。
[0018]作为本专利技术的进一步改进，步骤S2中所述NaCl溶液的浓度为7
‑
9g/L。
[0019]作为本专利技术的进一步改进，步骤S3中量取的标准尿激酶溶液的体积与步骤S5中待测样品的体积相同。
[0020]作为本专利技术的进一步改进，步骤S3中尿激酶溶液标准品的制备：先取无菌的生理盐水溶解尿激酶标准品，浓度为64aIU/支，制成32aIU/mL的溶液，再从上述溶液中稀释成16aIU/mL的溶液，进一步依次稀释成8aIU/mL、4aIU/mL、2aIU/mL、aIU/mL的标准尿激酶溶液；其中，a为自然数。
[0021]作为本专利技术的进一步改进，所述生理盐水的浓度为0.9
‑
1.2％W/V。
[0022]作为本专利技术的进一步改进，步骤S5中所述纳豆激酶活性的计算公式如下：
[0023]X＝C
×
V/M
ꢀꢀꢀꢀ
(1)
[0024]其中，X：样品纳豆激酶的活性，IU/g；C：通过回归方程计算的样品液中含有的纳豆激酶，IU/mL；V：样品稀释总体积，mL；M：样品质量，g。
[0025]本专利技术具有如下有益效果：本专利技术琼脂糖
‑
纤维蛋白平板法的原理是用琼脂糖作为固体支持，以凝血酶和纤维蛋白原作用后形成人工血栓平板，取已处理样品点于打孔的平板上，37℃恒温孵育18h，样品溶解琼脂糖
‑
纤维蛋白平板将形成透明圈，以溶圈面积大小的对数为横坐标，浓度对数为纵坐标作回归曲线，得出相应的回归方程。本专利技术根据回归方程计算样品中尿激酶活性大小。样品中的纳豆激酶以尿激酶活性大小IU计，表示纳豆激酶活性，方法简单，准确率高。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0027]图1为实施例1中纤维蛋白平板的示意图；
[0028]图2为实施例1中制得的标准曲线图。
具体实施方式
[0029]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0030]实施例1
[0031]本实施例提供一种纳豆激酶活性的检测方法，包括以下步骤：
[0032]1.使用试剂
[0033]1.1 A液：称量Tris 121.1g加水使溶解，并用约42mL浓盐酸调节pH至8.0，最后1L定容为母液。取母液10mL,加水稀释至500mL为A液。
[0034]1.2 B液：称量NaCl 9g加水使溶解，并定容到1L。
[0035]1.3 50mg/mL纤维蛋白原溶液：称量1g纤维蛋白原粉溶于20mLA液，使其充分溶解。
[0036]1.4 100U/mL的凝血酶溶液：将1000U凝血酶溶于10mlA液，使其充分溶解。
[0037]1.5尿激酶溶液标准品：先取2mL无菌的生理盐水(0.9％W/V)溶解尿激酶标准品(1240IU/支)，制成620IU/mL的溶液。再从上述溶液中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纳豆激酶活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.纤维蛋白平板的制备：将Tirs
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HCl溶液溶解琼脂后，加入NaCl混合加热至60
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80℃溶解，冷却至50℃时加入纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液，混合均匀后倾入灭菌平皿中，室温放置30
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40min，以形成纤维蛋白凝块；S2.待测样品溶液的制备：取待测样品，加NaCl溶液溶解，并稀释成标准曲线范围内的浓度；S3.尿激酶标准曲线的测定：用打孔器或注射器在纤维蛋白平板上打孔，并做好标识；取等体积各浓度的标准尿激酶溶液到对应的孔中，放置10
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20min后置于35
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37℃恒温培养箱中反应，16
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20h后取出测定各溶解圈的垂直两直径；S4.尿激酶标准曲线的绘制：用垂直直径的乘积(S)的常用对数为横坐标，标准尿激酶浓度的常用对数为纵坐标，制作尿激酶酶活标准曲线；S5.待测样品纳豆激酶活性的测定：取待测样品上样于同一平皿的孔中，放置10min后置于37℃恒温培养箱中反应，18h后测量溶解圈的垂直两直径，根据标准曲线方法及稀释浓度求出样品的纳豆激酶活性。2.根据权利要求1所述纳豆激酶活性的检测方法，其特征在于，步骤S1中所述Tirs
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HCl溶液的pH值为7.5
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8.5。3.根据权利要求1所述纳豆激酶活性的检测方法，其特征在于，步骤S1中所述琼脂、NaCl的质量比为5：(5
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6)。4.根据权利要求1所述纳豆...

【专利技术属性】
技术研发人员：范宇鹏，任佳鑫，张思文，
申请(专利权)人：湖北真福医药有限公司，
类型：发明
国别省市：