一种小RNA定量检测方法技术

本发明专利技术提供一种用于非疾病诊断和治疗目的的小RNA定量检测方法，该方法通过poly(A)加尾的小RNA逆转录得到cDNA，然后对所述的cDNA进行实时定量PCR扩增检测，得到目标小RNA的表达情况，用于逆转录的逆转录引物的序列组成为：5

【技术实现步骤摘要】
一种小RNA定量检测方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，具体地涉及一种小RNA定量检测方法。

技术介绍

[0002]小RNA包括micro RNA(miRNA)，short interfering RNA(siRNA)和其它多种的小非编码RNA(small non
‑
coding RNAs，ncRNA)，通常长度小于30个核苷酸。它们在生物体内大量存在，具有重要的生理作用。例如，miRNA是一种在转录水平调节基因表达的非编码小RNA，很多研究表明，miRNA在细胞的增殖、分化、凋亡、发育、肿瘤发生、肿瘤转移以及病毒感染等多种生理和病理过程中发挥重要作用。因此，不论在科学研究还是在临床诊断中，都具有重要的应用价值。研究发现某些miRNA能通过直接或间接的方式作用于原癌基因或抑癌基因而参与肿瘤的发生、发展，其含量与多种癌症存在关系。某些miRNA在血液中能稳定存在，对于不具有典型临床症状、检查无特异性和诊断困难的肿瘤患者，可以通过简单的抽血，检测特定miRNA的表达水平是否在正常范围内，从而筛查出是否患有某类肿瘤，可避免复杂的、具有创伤性的活检，因此，miRNA成为了肿瘤液体活检的重要靶标分子，这为肿瘤患者的无创诊断带来了希望。
[0003]研究者们在这个领域进行了大量的研究工作，开发出了多种小RNA的检测方法。其中反转录实时荧光定量PCR法(RT
‑
qPCR法)具有全封闭单管检测、操作方便、灵敏度高、特异性好、不需PCR后处理，避免了交叉污染和易于自动化等优点，正逐渐成为小RNA定量检测的主要方法。与一般的mRNA检测相同，检测小RNA时也包括逆转录和PCR两个步骤。但是，由于小RNA的长度一般只有不到30个核苷酸，如果直接针对其3
’
端的几个碱基序列设计逆转录引物，得到与小RNA互补的cDNA作为PCR步骤的模板，在设计PCR引物时，由于模板的长度过短，扩增的效率和特异性都比较差。并且，无法针对这么短的模板设计合适的探针。此外，不同小RNA的一些家族成员之间具有非常相似的序列，甚至只有一两个碱基的差别，所以小RNA的检测对特异性的要求很高。
[0004]目前主要有两种使用较广的定量检测小RNA的方法：
[0005]第一种方法是在逆转录前使用poly(A)聚合酶在小RNA的3
’
端加上一段poly(A)的序列(这个反应在分子生物学中称为加尾)，然后使用oligo dT做逆转录引物，逆转录得到cDNA，然后以该cDNA为模板设计引物进行实时定量PCR检测。这种方法的优点是无需设计特殊的逆转录引物，可以用oligo dT作为逆转录引物更方便地得到cDNA。但是，因为逆转录时所有被加了poly(A)尾的RNA都会被逆转录，缺乏特异性，针对目标序列的逆转录效率大大降低，非特异性的逆转录产物对后续PCR检测产生严重干扰，所以对PCR引物的优化有很高的要求。而且，由于小RNA后面被加上的poly(A)尾长度是不确定的，因此PCR产物的长度也不确定，导致PCR反应没有固定的Tm值，这样就无法通过熔解曲线来判断PCR反应的特异性。而小RNA的3
’
端加poly(A)尾长度不定以及逆转录反应的效率低都对检测结果有影响，因此有的时候该检测方法灵敏度也不太理想。此外，现有加尾反应和逆转录反应需要不同的反应体系，需要分步进行，实际操作时比较繁琐，且现有试剂盒若将加尾和逆转录同时进行，
会导致特异性差的问题。
[0006]第二种方法是茎环法，在逆转录时采用一个经过特殊设计的具有茎环结构的逆转录引物，其5
’
端的几个碱基与下游的一段序列互补，形成一个茎环结构，其3
’
端的几个碱基与小RNA的3
’
端互补。这样，逆转录产物就是一条较长的带有茎环结构的cDNA，然后，根据该cDNA的序列设计引物、探针通过PCR来检测小RNA。然而因为小RNA的长度都比较短，所以逆转录引物3
’
端与小RNA互补的一段长度只能在6到8个碱基，实际上很难保证逆转录的特异性，因此仅能通过设计的茎环结构来屏蔽非特异性结合，而茎环结构也会对PCR产生一些不良影响，由于PCR的反向引物、探针序列都是与茎环的序列互补，但是由于茎环本身有一段反向互补的序列，在退火时会对引物的结合形成阻碍、对探针的结合有竞争性抑制，从而导致PCR的效率显著降低。因此在设计PCR引物时，为了保证扩增的特异性，正向引物的序列就需要很小心地优化才能得到比较理想的结果。而且茎环逆转录引物设计方法较为复杂，为确保其特异性，针对同一样本中不同的目的miRNA，需要配制不同的逆转录体系，无法实现多种目标小RNA的同步检测。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种能够提高小RNA定量检测的特异性、灵敏度、以及检测效率的新方法。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]本专利技术提供一种用于非疾病诊断和治疗目的的小RNA定量检测方法，该方法通过poly(A)加尾的小RNA逆转录得到cDNA，然后对所述的cDNA进行实时定量PCR扩增检测，得到目标小RNA的表达情况，用于逆转录的逆转录引物的序列组成为：5
’‑
标签序列
‑
Oligo dT
‑
互补序列
‑3’
，其中，所述的互补序列与目标小RNA 3
’
端碱基互补，所述的标签序列无茎环结构。
[0010]优选地，所述的逆转录引物与poly(A)加尾的小RNA有12～21个碱基与模板互补(包括Oligo dT段和互补序列段)，结合效率大大提高。
[0011]优选地，所述的互补序列长度为4～8个碱基。
[0012]进一步优选地，所述的互补序列长度为4个碱基或5个碱基或6个碱基。
[0013]若互补序列过短(如2～3个碱基)的话，无法提供逆转录所需要的特异性；若互补序列过长的话，逆转录引物末端会与PCR正向引物末端形成互补，造成严重的假阳性。
[0014]优选地，所述的Oligo dT的长度为6～20个碱基。
[0015]进一步优选地，所述的Oligo dT的长度大于等于6个碱基，小于等于16个碱基，再进一步优选小于等于12个碱基，更进一步优选小于等于10个碱基。
[0016]更优选地，所述的Oligo dT的长度为6个碱基、7个碱基、8个碱基、9个碱基、10个碱基、11个碱基、12个碱基或13个碱基。
[0017]优选地，所述的标签序列的长度为10～150个碱基。
[0018]进一步优选地，所述的标签序列的长度大于等于15个碱基，再进一步优选地大于等于20个碱基；进一步优选地，所述的标签序列的长度小于等于120个碱基，再进一步小于等于100个碱基，更进一步小于等于80个碱基，再更进一步小于等于60个碱基。
[0019]优选地，所述的标签序列的长度为20个碱基、21个碱基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于非疾病诊断和治疗目的的小RNA定量检测方法，该方法通过poly(A)加尾的小RNA逆转录得到cDNA，然后采用Taqman探针法对所述的cDNA进行实时定量PCR扩增检测得到目标小RNA的表达情况，其特征在于，用于逆转录的逆转录引物的序列组成为：5
’‑
标签序列
‑
Oligo dT
‑
互补序列
‑3’
，其中，所述的互补序列与目标小RNA 3
’
端碱基互补，所述的标签序列无茎环结构，所述的标签序列与待检测样品中所有序列均不互补，所述的标签序列GC含量为40％～60％，所述探针的序列与所述的标签序列的一段相同，所述的小RNA定量检测方法用于同时检测多种目标小RNA的表达情况，不同的所述的逆转录引物的5
’
端的所述的标签序列不同，不同的探针使用不同的标记物。2.根据权利要求1所述的小RNA定量检测方法，其特征在于，所述的互补序列长度为4～8个碱基，和/或，所述的Oligo dT的长度为6～20个碱基，和/或，所述的标签序列的长度为10～150个碱基。3.根据权利要求1所述的小RNA定量检测方法，其特征在于，所述的标签序列的长度为15～100个碱基，所述的Oligo dT的长度为8～15个碱基，所述的互补序列的长度为4～6个碱基。4.根据权利要求1所述的小RNA定量检测方法，其特征在于，用于所述的实时定量PCR扩增检测的反向引物的序列包括所述的标签序列的全部或部分。5.根据权利要求1所述的小RNA定量检测方法，其特征在于，适用于所述的小RNA定量检测方法的待检测样品包括总RNA、纯化的小RNA或合成的小RNA。6.根据权利要求1所述的小RNA定量检测方法，其特征在于，所述的小RNA包括miRNA、siRNA或ncRNA中的一种或多种。7.根据权利要求1至6中任一项所述的小RNA定量检测方法，其特征在于，所述的小RNA定量检测方法具体包括：(1)在poly(A)聚合酶的作用下，待检测样品中小RNA的3
’
端加上一段poly(A)序列，得到poly(A)加尾的小RNA；(2)步骤(1)中所得的poly(A)加尾的小RNA在所述逆转录引物的作用下逆转录形成cDNA；(3)采用Taqman探针法对步骤(2)中所得的cDNA进行实时定量PCR扩增检测，得到目标小RNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓雷，袁新旺，徐超，闫媛媛，刘冠宏，
申请(专利权)人：上海圣梓茂生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：