一种基于宏转录组学和宏基因组学的环境中抗生素抗性基因的活性定量及宿主鉴定方法技术

本发明专利技术涉及一种基于宏转录组学和宏基因组学的环境中新型抗生素抗性基因的活性定量方法。具体包括以下步骤：1)从环境微生物样本中提取总DNA和RNA；2)DNA样品进行宏基因组测序；RNA样品进行宏转录组测序；3)通过对宏基因组测序以及宏转录组测序结果进行分析，识别新型抗生素抗性基因及其宿主，并对其活性进行定量。本发明专利技术的方法不依赖菌株分离培养，结合了宏基因组和宏转录组方法能够实现环境微生物样品中抗生素抗性基因的活性定量及其宿主鉴定。定。定。

【技术实现步骤摘要】
一种基于宏转录组学和宏基因组学的环境中抗生素抗性基因的活性定量及宿主鉴定方法


[0001]本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种基于宏转录组学和宏基因组学的环境中新型抗生素抗性基因的活性定量及宿主鉴定方法。

技术介绍

[0002]抗生素抗性基因(ARG)作为环境污染物，其传播和扩散已经成为威胁全球人类健康的重要问题。目前针对ARG的检测多数是针对已知的ARG，缺乏对新型ARG的鉴定和认识，造成了对环境中ARG类群的低估。以往针对ARG的定量检测主要通过PCR和宏基因组等技术在DNA水平进行ARG分析，忽视了ARG的表达活性问题。高度活跃表达的ARG对于人类的健康的威胁更大，亟需开发新的检测和分析方法以定量检测环境中ARG的表达水平。
[0003]以往对于环境微生物群体中抗性基因的活性定量检测主要借助QPCR技术，但该技术难以定位基因的宿主，无法在菌株水平(尤其对于环境中难分离培养的菌株)对抗性基因活性进行定量分析。

技术实现思路

[0004]针对以上问题，本专利技术联合应用宏基因组和宏转录组能够获得环境微生物群体的所有基因信息和表达量信息，能够实现新型抗性基因的分析、表达活性定量及宿主鉴定。
[0005]本专利开发了基于宏转录组和宏基因组的测序和分析方法，实现了环境中新型抗生素抗性基因的活性定量检测及其宿主定位。
[0006]本专利技术一个方面提供了一种微生物抗生素抗性基因的表达活性定量检测及其宿主定位方法，其包括以下步骤：
[0007]1)从环境样本中提取总DNA和RNA；
[0008]2)DNA样品进行宏基因组测序；RNA样品进行宏转录组测序；
[0009]3)通过对宏基因组测序以及宏转录组测序结果进行分析，识别抗生素抗性基因及其宿主，并对其活性进行定量；
[0010]步骤3)中，所述分析的方法包括以下步骤：
[0011]3‑
1)对宏基因组原始数据进行质控和过滤，并进行组装和分箱后获得单菌基因组；
[0012]3‑
2)去除相似度高的冗余基因组，并对剩余非冗余基因组进行物种注释；
[0013]3‑
3)对非冗余基因组中的CDS区进行预测，并将非冗余基因组中的CDS区整合为参考基因集，并对参考基因集进行注释，并比对目的抗性基因的参考序列，识别出目的抗性基因，根据3
‑
2)中物种注释结果获得目的抗生素抗性基因的宿主的物种分类信息；
[0014]3‑
4)对宏转录组原始数据进行质控和过滤，并将处理后的数据映射到所述参考基因集上，获得对应基因的表达量数据。
[0015]在本专利技术的技术方案中，所述抗生素抗性基因的表达活性定量检测方法是针对环
境样本中的微生物进行检测的方法。所述检测方法检测样本不来自于有生命的人体或动物体。
[0016]在本专利技术的技术方案中，所述抗生素抗性基因的表达活性定量检测方法是非诊断和治疗目的的。
[0017]在本专利技术的技术方案中，所述的环境样本选自来自于环境水体、土壤、沉积物的微生物样本。
[0018]在本专利技术的技术方案中，在步骤3
‑
1)中，宏基因组原始数据分别通过FastQC和Fastp进行质控和过滤。
[0019]在本专利技术的技术方案中，在步骤3
‑
1)中，使用软件metaSpades组装质控和过滤后的数据。
[0020]在本专利技术的技术方案中，在步骤3
‑
1)中，使用软件Maxbin2、metaBAT和CONCOCT进行分箱，获得单菌基因组。
[0021]在本专利技术的技术方案中，在步骤3
‑
2)中，使用软件drep去除冗余基因组。
[0022]在本专利技术的技术方案中，在步骤3
‑
2)中，通过软件GTDB
‑
Tk对非冗余基因组进行物种注释。
[0023]在本专利技术的技术方案中，在步骤3
‑
3)中，通过软件prodigal对非冗余基因组中的CDS区进行预测。
[0024]在本专利技术的技术方案中，在步骤3
‑
3)中，通过blast比对NR数据库注释参考基因集，通过blast比对目的抗性基因序列识别抗性基因。
[0025]在本专利技术的技术方案中，在步骤3
‑
4)中，宏转录组原始数据分别通过FastQC和Fastp进行质控和过滤。
[0026]在本专利技术的技术方案中，在步骤3
‑
4)中，通过软件Bowtie2进行数据映射，使用HTseq(v 0.13.5)从映射结果文件中获得基因表达量数据。
[0027]在本专利技术的技术方案中，在步骤3
‑
4)中还包括，计算目的抗性基因基因在实验组之间的每两组数据中表达量差异倍数，通过DEseq2计算基因在两组宏转录组数据中表达量差异倍数和差异显著性。
[0028]有益效果
[0029]本专利技术的方法结合了宏基因组和宏转录组数据，通过分析对抗性基因的活性进行定量，并获得抗性基因的宿主信息。
附图说明
[0030]图1为比对上GMC氧化酶参考基因的序列比对信息结果。Per.ident为相似度，Acc.Len为序列长度。
具体实施方式
[0031]为了使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本专利技术的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本专利技术的可实施范围的限定。
[0032]实施例1定量检测和数据分析方法
[0033](1)样品采集及核酸提取
[0034]采集环境水体或土壤微生物样品，使用液氮速冻，在核酸提取之前保存于
‑
80℃。
[0035]使用FastDNATM Spin Kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals，美国)提取样品总DNA。通过1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并使用Nanopdrop检测DNA浓度。
[0036]使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN，美国)提取样品总RNA，并使用RNase
‑
Free DNase Set(QIAGEN，美国)消化残余的基因组DNA。提取后的核酸样品保存于
‑
80℃。
[0037](2)宏基因组测序和宏转录组测序
[0038]DNA样品通过Illumina NovaSeq(PE150)平台进行宏基因组测序，测序深度约10Gb。测序过程简述如下：通过超声波破碎仪(Covaris，美国)将DNA样品随机打断成350bp的片段；使用UltraTM DNA Library Prep Kit for Illumina(NEB，美国)试剂盒进行建库。
[0039]RNA样品通过Illumina NovaSeq(PE150)平台进行宏转录组测序，测序深度约10Gb。建库过程如下：富集mRNA后将RNA链随机打断，将RNA片段逆本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微生物抗生素抗性基因的表达活性检测及其宿主定位方法，其特征在于，其包括以下步骤：1)从环境样本中提取总DNA和RNA；2)对DNA样品进行宏基因组测序；对RNA样品进行宏转录组测序；3)通过对宏基因组测序以及宏转录组测序结果进行分析，识别抗生素抗性基因及其宿主，并对其表达活性进行定量；步骤3)中，所述分析的方法包括以下步骤：3
‑
1)对宏基因组原始数据进行质控和过滤，并进行组装和分箱后获得单菌基因组；3
‑
2)去除冗余基因组，并对非冗余基因组进行物种注释；3
‑
3)对非冗余基因组中的CDS区进行预测，并将非冗余基因组中的CDS区整合为参考基因集，并对参考基因集进行注释，并比对目的抗性基因的参考序列，识别出目的抗性基因，根据3
‑
2)中物种注释结果获得目的抗生素抗性基因的宿主的物种分类信息；3
‑
4)对宏转录组原始数据进行质控和过滤，并将处理后的数据映射到所述参考基因集上，获得对应基因的表达量数据；优选地，所述抗生素抗性基因的表达活性检测方法是针对环境样本中的微生物进行检测的方法。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤3
‑
1)中，使用软件metaSpades组装质控和过滤后的数据。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤3
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：李炳，张家禹，梁贺彬，黄锦，雷华新，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，
类型：发明
国别省市：