极地来源的弯孢聚壳属真菌原生质体的制备方法技术

本发明专利技术公开了极地来源的弯孢聚壳属真菌原生质体的制备方法，包括(1)新鲜菌丝体制备：取活化培养了2

【技术实现步骤摘要】
极地来源的弯孢聚壳属真菌原生质体的制备方法


[0001]本专利技术属于真菌原生质体制备及再生
，具体涉及一种极地来源的弯孢聚壳属真菌Eutypella sp.D
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1原生质体的制备方法。

技术介绍

[0002]弯孢聚壳属真菌Eutypella sp.D
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1分离自北极地区，可以产生一系列结构独特的次级代谢产物，比如倍半萜、海松烷二萜、细胞松弛素类和甾体类等化合物，其中大部分次级代谢产物都有较好的抗菌和抗肿瘤活性。前期，专利技术人对Eutypella sp.D
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1采用了单菌多产物(OSMAC)策略，获得了丰富的代谢产物，但没有真正从基因层面对该菌进行探究。
[0003]为了更好的挖掘该菌株产结构独特且活性多样的次级代谢产物能力，可采用生物合成技术激发菌株的沉默基因，提高其产次级代谢物的能力。经基因组测序并进行生物信息学分析之后，发现该真菌的次级代谢产物生物合成基因簇在常规的实验条件下往往表达很少，如果激活或改造微生物基因簇，可以充分发掘其产生次级代谢产物的潜力。
[0004]原生质体是指去除了细胞壁之后的细胞成分，随着分子生物学技术的发展，其已成为研究真菌分子遗传学的重要工具。对于真菌的遗传转化最常见的是原生质体介导的转化方法。近年来，许多学者对真菌的原生质体的制备和转化进行了大量的研究，闫思远等通过构建枸杞内生轮状镰刀菌(Fusarium nematophilum)NQ8GⅡ4菌株原生质体，PEG介导外源DNA转入原生质体，获得GFP标记的转化子，为阐明该菌与宿主植物相互作用的规律奠定基础；农倩等通过构建裂壳菌L
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14原生质体制备和再生体系，通过多因素实验获得最优制备方案，使再生率达到10.65％，为建立该菌株遗传转化体系奠定基础。
[0005]真菌原生质体为球状单细胞，其由于去除了细胞壁，更易摄取外源物质，使得能够人为的有效靶向和改造基因，以揭示及研究基因的功能。在真菌次级代谢产物的研究中，可以通过原生质体转化技术，靶向与次级代谢产物合成相关的基因，来揭示基因在相关代谢途径中的具体作用。对于弯孢聚壳属真菌原生质体的制备尚未有相关报道，为了进一步研究该属真菌次级代谢产物合成机理，以挖掘其次级代谢产物合成能力，需要对弯孢聚壳属真菌原生质体的制备与再生进行研究。

技术实现思路

[0006]本专利技术依托上述研究进行，提供了一种极地来源的弯孢聚壳属真菌原生质体的制备方法。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0007]本专利技术的第一方面，提供了极地来源的弯孢聚壳属真菌D
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1(Eutypella sp.D
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1)原生质体的制备方法，包括如下步骤：
[0008](1)新鲜菌丝体制备：刮取固体平板上活化培养了2
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3代的菌丝体或取菌株种子液接种至马铃薯葡萄糖水PDB液体培养基中摇瓶培养。
[0009]采用固体菌丝培养时，培养时间为3d；采用液体菌丝培养时，菌株种子液与马铃薯葡萄糖水PDB液体培养基的体积比为1:10，培养时间为1d。
[0010](2)菌丝体收集：取步骤(1)中获得的菌丝体于无菌离心管中，8000rpm离心10min 弃上清后使用浓度为0.65～0.85mol/L的灭菌渗透压稳定剂清洗2
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3次，弃上清得到待用菌丝体。
[0011]由于缺失了细胞壁，原生质体需要适宜的渗透压稳定剂来维持细胞形态，渗透压过高或过低，会使原生质体皱缩或涨破，导致原生质体质量下降。
[0012]本专利技术中，所用灭菌渗透压稳定剂为NaCl溶液，经115℃、30min灭菌后制得。优选浓度为0.7～0.75mol/L，更优选0.75mol/L。
[0013](3)酶解液的制备：制备终浓度均为10
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20mg/mL(优选20mg/mL)的裂解酶及崩溃酶复合酶液，按体积比为1:1、2:1或1:2称取复合酶液于渗透压稳定剂中，而后置于水平摇床120rpm充分溶解，再经0.22μm微孔滤膜过滤后，冷藏待用。
[0014](4)原生质体制备：将步骤(3)所制备的酶解液加入到步骤(2)所收集的菌丝体中，充分混匀分散后，于120rpm摇床下24
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30℃恒温培养4
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6h，优选28℃恒温培养4
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6h。
[0015](5)原生质体收集：将步骤(4)的混合液用四层灭菌擦镜纸进行过滤，2500rpm离心 10min，弃上清后使用灭菌NaCl渗透压稳定剂清洗2次，并采用该渗透压稳定剂重悬原生质体。
[0016](6)原生质体再生：将步骤(5)制备好的原生质体悬液与冷却到50℃的再生培养基混合，倒平板凝固后于28℃培养箱中培养3d，观察复苏情况。
[0017]该再生培养基的组成如下：蔗糖200g/L、酵母3.5g/L、胰蛋白胨5g/L、琼脂粉15g/L
[0018]作为优选的技术方案，本专利技术提供的极地弯孢聚壳属真菌原生质体的制备方法，最佳工艺参数为：
[0019]取5mL菌株种子液接种到50mL马铃薯葡萄糖水PDB液体培养基中摇瓶培养1d。所获得的菌丝体10mL于无菌离心管中，8000rpm离心10min，弃上清后使用灭菌0.75M NaCl 渗透压稳定剂清洗2
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3次，弃上清后得到待用菌丝体。制备终浓度为20mg/ml裂解酶， 20mg/mL崩溃酶组合的复合酶液于10mL 0.75M NaCl渗透压稳定剂中，置于水平摇床 120rpm充分溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤后使用。将所制备的酶解液加入到菌丝体中，菌丝体充分混匀分散，于120rpm摇床下28℃恒温培养6h。获得的混合液用4层灭菌擦镜纸进行过滤，2500rpm离心10min，弃上清后使用灭菌0.75M NaCl渗透压稳定剂清洗2 次，使用500μl渗透压稳定剂重悬原生质体。将制备好的原生质体悬液与冷却到50℃左右的再生培养基混合，倒平板凝固后于28℃培养箱中培养3d，观察复苏情况。
[0020]本专利技术的第二方面，提供采用上述制备方法制备得到的弯孢聚壳属真菌Eutypella sp. D
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1原生质体。
[0021]该制备得到的原生质体进可用于原生质体转化技术，靶向与次级代谢产物合成相关的基因，来揭示基因在相关代谢途径中的具体作用。如用于激活或改造弯孢聚壳属真菌 Eutypella sp.D
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1次级代谢产物生物合成基因簇，充分发掘其产生次级代谢产物的潜力。
[0022]本专利技术对各步骤的工艺条件选择及有益效果说明如下：
[0023](1)菌丝体生长周期及状态对原生质体产生的数量有非常重要的影响，一般新鲜幼嫩的菌丝是制备原生质体最好的材料，若培养周期过短，菌丝体数量过少，会导致原生质体产量过低；若培养周期过长，则菌丝体会老化，细胞壁增厚难以酶解，因此要选用合适阶段的菌丝体。本专利技术方法通过实验摸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
sp.D
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【专利技术属性】
技术研发人员：卢小玲，宁耀东，胡波，于豪冰，刘小宇，孔杰，徐尧，焦炳华，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军军医大学，
类型：发明
国别省市：