一种绵羊骨骼肌卫星细胞的高效分离和纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种绵羊骨骼肌卫星细胞的高效分离和纯化方法，包括如下步骤：75%酒精浸泡肌肉组织15min后，切取所需骨骼肌，用含有1%双抗的PBS清洗，去除结缔组织，剪碎至2mm3移入离心管后PBS反复吹打3次，自然沉降，弃上清液,将组织块移入培养瓶中,吸去多余液体,每25cm2生长面加入1ml培养基，缓慢倾斜培养瓶至组织块均匀分布于生长面，盖瓶盖后37℃，5%CO2，饱和湿度培养8

【技术实现步骤摘要】
一种绵羊骨骼肌卫星细胞的高效分离和纯化方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种绵羊骨骼肌卫星细胞的高效分离和纯化方法。

技术介绍

[0002]骨骼肌卫星细胞（SMSCs）是一种成体干细胞，它也是与骨骼肌生长和修复相关的肌原性的前体细胞，其位于肌纤维的基膜和基底膜之间。由于其独特的存在位置，骨骼肌卫星细胞的分离过程不同于其他细胞如肌纤维细胞的分离及纯化，相较于其他细胞的分离，骨骼肌卫星细胞的分离方法更复杂，更加困难。再者，SMSCs分离过程中通常掺杂着其他细胞，比如成纤维细胞、内皮细胞和其它血管相关的细胞等等，因此如果要得到纯度较高的骨骼肌卫星细胞，必须结合科学合理的纯化方法。在细胞的分离实验中，常用的方法有两种，一种是原代外植块培养法（Primary explants culture）；另一种是两步酶消化法（Twosteps enzyme gradation digestion）。
[0003]在原代外植块培养（也叫组织块培养）中，在培养基质中各类细胞的贴附顺序不同。一些前体细胞主要在早期贴附，培养后期贴附的细胞则具有一定原始细胞的特征，例如骨骼肌卫星细胞。有研究已经证实后期贴附细胞有着不典型的增殖模式和多能分化特性。因此可以通过控制细胞贴附所需时间的先后顺序来纯化骨骼肌卫星细胞。对于SMSCs的培养，多项研究采用了分步酶消化法，其中所选用的酶主要有胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶和链激酶等等。然后结合差速贴壁法进行纯化，其原因是由于成纤维细胞在体外培养中有较强的增殖活力和增殖速度，而且其形态特征不易与肌细胞区别，因此纯化以去除混杂的成纤维细胞。差速贴壁法原理为，当细胞接种数小时后，成纤维细胞先贴壁，此时可以将细胞悬液回收并进行第2次接种，从而可以获得纯度较高的SMSCs。当在倒置相差显微镜下看到大量的纺锤形单核细胞出现，此细胞即为开始贴壁的骨骼肌卫星细胞。因为多步酶消化法可能清除骨骼肌卫星细胞的表面抗原，从而使得细胞的完整性受到破坏，再导致细胞功能的紊乱，而且大多是细胞在经过多次酶的处理后容易被消化，从而引起大量细胞的损失，因此相关研究曾尝试用组织块培养法来克服这些困难。SMSCs的分离培养也可以采用组织块培养法。但，随着培养时间的延长，卫星细胞汇合度增加并逐渐相互融合，从而形成多核的肌管，最终形成具有方向性的成束骨骼肌细胞。
[0004]由于细胞的生长过程包括增殖期、停滞期以及分化期，因此曾有研究利用细胞的这一生长特性，先用增殖培养基（配方为：F10 + 10% FCS）使细胞处于增殖期以收集足够的数量。在卫星细胞的培养过程中，其培养基的配方决定着细胞生长的方向，具体讲，主要决定细胞培养方向的是培养基中的血清浓度：当培养基中血清浓度较高时（比如，FBS浓度达10%
‑
20%），SMSCs以分裂增殖为主; 而当血清浓度较低时（比如，FBS浓度为1%
‑
5%），SMSCs则以分化为主。另外，培养环境对SMSCs的生长也有一定影响，其中氧气浓度对细胞生长影响最大，通常，低氧条件有利于细胞增殖。有研究将SMSCs经胶原酶消化后置于低氧状态（2% O2，37 ℃）中进行培养，当细胞培养至开始融合，进一步改用分化培养基（DM），其配方为
DMEM+2%FBS+1% 双抗+1% 胰岛素
‑
转铁因子
‑
硒补充剂+0.4mg /mL地塞米松，实验结果证明此培养条件可以促进SMSCs的分化。
[0005]目前常用的两步酶消化分离骨骼肌卫星细胞的方法中所用酶类（如胶原酶、胰蛋白酶等）对细胞有着较大的损伤作用，因此通过两步酶法得到的细胞往往数量较少或者生长过程迟缓。而常用的细胞纯化方法有差速贴壁法和percoll梯度离心法等，离心过程可对细胞造成严重损失，从而降低细胞收集效率。

技术实现思路

[0006]为解决上述问题，本专利技术提供了一种绵羊骨骼肌卫星细胞的高效分离和纯化方法。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种绵羊骨骼肌卫星细胞的高效分离和纯化方法，包括如下步骤：S1、采用改良的原代外植块培养法实现绵羊骨骼肌卫星细胞的分离75%酒精浸泡肌肉组织15min
ꢀ→
超净台中切取所需骨骼肌，用含有1%双抗的PBS清洗
→
尽可能去除脂肪、肌腱、肌膜等结缔组织
→
剪碎至2 mm3左右移入离心管后PBS反复吹打3次，自然沉降5分钟，弃上清液
→
将组织块移入培养瓶中（应该预先润湿移液管），每25cm2培养瓶中大约接种25块左右组织块
→
吸去多余液体
→
每25cm2生长面加入1ml培养基
→
缓慢倾斜培养瓶至组织块均匀分布于生长面
→
盖瓶盖后37 ℃，5%CO
2，
饱和湿度培养8
‑
24h
→
然后加入1ml培养基
→
连续每隔24h加入1ml培养基，直至培养基体积为5ml/25cm2→
每周换液一次，直至细胞生长趋于稳定
→
至汇合度达到50%便可纯化细胞；S2、采用改良的差速贴壁法实现绵羊骨骼肌卫星细胞的纯化将消化后所得细胞悬液加入培养瓶中，37℃，5%CO
2，
饱和湿度培养2h
→
缓慢吸出培养液，将其加到新的预铺明胶的培养瓶中
→
经12h后再吸出培养液
→
加到新的培养瓶中，即可得到纯的骨骼肌卫星细胞。
[0008]本专利技术的方法成本低且对细胞损伤极小，因此可以收集更多的细胞。
附图说明
[0009]图 1为不同时期原代肉羊骨骼肌卫星细胞形态变化图；图中：A：培养第一天的0月龄肉羊半腱肌原代卫星细胞；B：培养第三天的0月龄肉羊半腱肌原代卫星细胞；C：培养第五天的0月龄肉羊半腱肌原代卫星细胞；D：培养第八天的0月龄肉羊半腱肌原代卫星细胞。
[0010]图 2 为传代后不同时期肉羊骨骼肌卫星细胞的形态变化图；图中：A：培养第一天的0月龄肉羊半腱肌第二代卫星细胞；B：培养第二天的0月龄肉羊半腱肌第二代卫星细胞；C：培养第四天的0月龄肉羊半腱肌第二代卫星细胞；D：培养第五天的0月龄肉羊半腱肌第二代卫星细胞。
[0011]图 3为不同代数肉羊骨骼肌卫星细胞的 HE 染色结果图；图中：A:原代细胞；B：第二代细胞：C：第六代细胞；D：第八代细胞；E：第十二代细胞；F：第十八代细胞；图4为肉羊骨骼肌卫星细胞免疫组织化学鉴定结果
图中：A:第8代骨骼肌卫星细胞;B:Desmin;C:第8代骨骼肌卫星细;D:MYH1; E:第8代骨骼肌卫星细胞;F:
ɑ
‑
Actinin;G:第8代骨骼肌卫星细胞;H:Myostatin;I:第8代骨骼肌卫星细胞;J:Pax7;第8代骨骼肌卫星细胞中Desmin、
ɑ
‑
Actinin、MYH1和Myostati本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种绵羊骨骼肌卫星细胞的高效分离和纯化方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、采用改良的原代外植块培养法实现绵羊骨骼肌卫星细胞的分离75%酒精浸泡肌肉组织15min
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超净台中切取所需骨骼肌，用含有1%双抗的PBS清洗
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去除脂肪、肌腱、肌膜
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剪碎至2 mm3移入离心管后PBS反复吹打3次，自然沉降5分钟，弃上清液
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将组织块移入培养瓶中，每25cm2培养瓶中接种25块组织块
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吸去多余液体
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每25cm2生长面加入1ml培养基
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缓慢倾斜培养瓶至组织块均匀分布于生长面
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盖瓶盖后37 ℃，5...

【专利技术属性】
技术研发人员：乌日罕，冯青辉，格日勒图，付艳茹，
申请(专利权)人：呼和浩特职业学院，
类型：发明
国别省市：