一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法技术

本发明专利技术涉及植物基因工程技术领域，且公开了一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，所述该载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。该适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，通过对含有棉花内源启动子pGhU6

【技术实现步骤摘要】
一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法


[0001]本专利技术涉及植物基因工程
，具体为一种适用于陆地棉的基因精 准高效编辑的方法。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas系统(Clustered regularlyinterspaced short palindromicrepeats/CRISPRassociated protein)是细菌和古菌在抵御外来病毒和噬菌体 入侵的过程中不断迚化而来的一种获得性免疫防御机制，CRISPR/Cas9系统是 目前应用最多最广泛的基因编辑系统，能够高效特异和灵活的识别靶基因中 的特定位点，然而，随着研究的不断深入，CRISPR/Cas9也暴露了比较严重的 脱靶效应(Hsu et al 2014)、PAM序列的限制导致其切割位点较少及基因编 辑后后代不易纯合等缺陷，因此需要改造CRISPR/Cas9系统，降低其脱靶效 应，提高基因编辑精准度，扩大靶标位点范围，寻找新的基因编辑系统。
[0003]Geminivirus是一类拥有众多成员的植物病毒，它们的基因组由2.5
‑
3kb 的单链环状DNA组成，能浸染大多数单子叶和双子叶植物，并且能被改造成 HDR所需的供体分子，当Geminivirus浸染植物细胞后，它们具有快速浸染、 增殖、转录、表达而不整合入植物基因组的特点，从使得细胞内以滚环复制 的方式产生大量的供体分子，数量可高达数百至数千拷贝，一次，将生病毒 在植物体内滚环复制提供大量sgRNA模板，可大量增加植物体内的Cas9蛋白 和sgRNA含量可以有效的促进在植物基因组中精确高编辑。
[0004]目前，BeYDV介导的基因编辑系统系统在很多物种中被报道，但是在异源 四倍体棉花中尚无报道，陆地棉是一种广泛种植的异源四倍体(AtDt)，其基 因组中的许多基因具有高度同源性，并且基因组比较复杂及庞大，传统的 CRISPR
‑
Cas9系统在需要对某些特定基因进行编辑及功能分析时无能为力，其 并无可行而又有效的精准编辑工具，为棉花基因组功能分析，作物遗传改良 和新品种选育提供重要技术支持，因此难以满足社会需求，故而提出一种适 用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法来解决上述中所提出的问题。

技术实现思路

[0005](一)解决的技术问题
[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种适用于陆地棉的基因精准高效 编辑的方法，具备可精准编辑基因等优点，解决了传统的CRISPR
‑
Cas9系统 在对陆地棉进行基因编辑时无能为力，且并无可行有效编辑工具的问题。
[0007](二)技术方案
[0008]为实现上述可精准编辑基因的目的，本专利技术提供如下技术方案：一种适 用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，所述该载体的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
[0009]一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，所述该载体的核苷酸序 列如SEQ ID NO:2所示，该载体通过下列步骤制备获得：
[0010]1)、获得目的序列复制子元件(BeSRL)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO： 3所
示，具体地，该目的序列通过以下步骤制备获得：
[0011](1)、利用XbaⅠ对SEQ ID NO：1所示的pRGEB32
‑
GhU6.7
‑
NPTⅡ(序列 表SEQ ID NO：1)载体进行酶切；
[0012](2)、与复制子序列元件BeSRL目的序列进行连接；
[0013](3)、通过测序验证，得到如SEQ ID NO：4所示的适用于陆地棉的基因 敲入的基础载体BeYDV
‑
pRGEB32
‑
1；
[0014]2)、获得目的序列复制子元件(ULIR)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO： 5所示，具体地，该目的序列通过以下步骤制备获得：
[0015](1)、Afe I对SEQ ID NO：4所示的BeYDV
‑
pRGEB32
‑
1载体进行酶切；
[0016](2)、与复制子序列元件BeSRL目的序列进行连接；
[0017](3)、通过测序验证，得到如SEQ ID NO：2所示的适用于陆地棉的基因 敲入的高效转化载体BeYDV
‑
Cas9。
[0018]优选的，所述的载体BeYDV
‑
Cas9在陆地棉基因组编辑中的应用。
[0019](三)有益效果
[0020]与现有技术相比，本专利技术提供了一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑 的方法，具备以下有益效果：
[0021]1、该适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，通过对含有棉花内源启 动子pGhU6
‑
7的pRGEB32
‑
GhU6.7
‑
NPTⅡ载体进行改造，以BeYDV双生病毒中 复制子元件为载体，将sgRNA序列构建在复制环内，构建了在棉花中具有基 因编辑功能的载体BeYDV
‑
Cas9，选取GhCLA为目标基因验证BeYDV
‑
Cas9在棉 花中的应用，并且设计1个靶标，利用农杆菌介导的遗传转化将BeYDV
‑
Cas9 基因编辑系统导入棉花基因组，对转基因植株进行Sanger测序，检测本专利技术 在异源四倍体棉花基因组中的编辑效率类型，达到了具有较高编辑效率和特 异性的效果。
[0022]2、该适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，通过合成菜豆黄矮病毒 的复制子元件BeSRL，利用Xba I对SEQ ID NO：1所示的pRGEB32
‑
GhU6.7
‑
NPT
ꢀⅡ
载体进行酶切，与复制子序列元件BeSRL目的序列进行连接，通过测序验 证，得到如SEQ ID NO：4所示的适用于陆地棉的基因编辑的中间载体 BeYDV
‑
pRGEB32
‑
1，以及利用Afe I对SEQ ID NO：2所示的BeYDV
‑
pRGEB32
‑
1 载体进行酶切，与复制子序列元件BeSRL目的序列进行连接，通过测序验证， 得到如SEQ ID NO：2所示的适用于陆地棉的基因敲入的高效转化载体 BeYDV
‑
Cas9，该专利技术在棉花中的基因编辑效率达到95％，并且在棉花中的基因 编辑类型小片段插入和片段缺失，其具备较好的适用性，从而有效的解决了 传统的CRISPR
‑
Cas9系统在对陆地棉进行基因编辑时无能为力，且并无可行 有效编辑工具的问题。
附图说明
[0023]图1为本专利技术提出的一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法中载 体pRGEB32
‑
GhU6.7
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NPTⅡ的载体图；
[0024]图2为本专利技术提出的一种适本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，其特征在于：所述该载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，其特征在于：所述该载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，该载体通过下列步骤制备获得：1)、获得目的序列复制子元件(BeSRL)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示，具体地，该目的序列通过以下步骤制备获得：(1)、利用XbaⅠ对SEQ ID NO：1所示的pRGEB32
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GhU6.7
‑
NPTⅡ(序列表SEQ ID NO：1)载体进行酶切；(2)、与复制子序列元件BeSRL目的序列进行连接；(3)、通过测序验证，得到如SEQ ID NO：4所示的适用于陆地棉的基因敲入的基础载体BeYDV

【专利技术属性】
技术研发人员：金双侠，张献龙，余露，王琼琼，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：