pSOY19-ZM3载体、其制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及转基因大豆技术领域，公开了pSOY19

【技术实现步骤摘要】
pSOY19
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ZM3载体、其制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及转基因大豆
，具体涉及pSOY19
‑
ZM3载体、其制备方法及应用。

技术介绍

[0002]大豆(GLycine max.Merr.)是重要的油料作物和国民的蛋白质源，在农业生产上意义重大。大豆生长过程中，病虫草害严重影响了大豆的产量与品质，与国外大豆生产相比较，我国大豆生产竞争力很弱，85％以上依赖于进口，是一个被“卡脖子”的问题。因此，急需通过培育优质抗性品系来提高我国大豆的产量及品质，提高大豆生产的国际竞争力。
[0003]之前获得的抗除草剂转基因大豆均为组成型表达，即所产生的转基因大豆种子中也有EPSPS蛋白的积累，且积累量较高，这导致公众无法充分认可转基因大豆的食用安全性，因此专利技术人研发了pSOY19
‑
ZM3载体、其制备方法及应用，在保证高效抗除草剂的条件下降低种子中抗除草剂蛋白含量。

技术实现思路

[0004]基于以上问题，本专利技术提供pSOY19
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ZM3载体、其制备方法及应用，本专利技术使抗除草剂蛋白在大豆的叶片等绿色组织中表达，而在种子中低表达或者零表达。
[0005]为解决以上技术问题，本专利技术提供了pSOY19
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ZM3载体，pSOY19
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ZM3载体由绿色组织特异启动子PGmRCAβ和切除了35S启动子的pSOY19载体连接而成。
[0006]为解决以上技术问题，本专利技术还提供了载体的制备方法，包括如下步骤：
[0007]S1：对GmRCAβ基因的起始密码子上游2278bp的启动子序列进行PCR扩增，扩增引物如下：
[0008]PGmRCAβ
‑
F：
[0009]cccgggtaccgagctcGAATTCAGAGTCACAAACCTTTTCAACT，
[0010]PGmRCAβ
‑
R：
[0011]gagactggtgatGAATTCGGATGATGATGTCTTTGTGTTTG；得扩增的PGmRCAβ片段，备用；
[0012]S2：用EcoRI和NcoI双酶切除植物表达载体pSOY19载体中的35S启动子，备用；
[0013]S3：将步骤S1中的PGmRCAβ片段与步骤S2中切除了35S的pSOY19载体相连，得pSOY19
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ZM3载体。
[0014]为解决以上技术问题，本专利技术还提供了载体在增加大豆抗除草剂能力且降低大豆种子中抗除草剂蛋白含量的产品中的应用。
[0015]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术的载体利用大豆绿色组织特异启动子来启动抗除草剂基因G10
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EPSPS基因的表达，从而使抗除草剂蛋白在大豆叶片等绿色组织中表达，而在种子中低表达或者零表达，以此减轻公众对转基因大豆安全性的顾虑，提高公众对转基因大豆的接受度，同时也提高了大豆抗除草剂能力，提高了大豆的产量，本专利技术的应用将为培育高效抗草甘膦且种子中抗草甘膦蛋白降低的转基因农作物开辟一条更直接更有效的道路。
附图说明
[0016]图1为本专利技术的pSOY19
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ZM3载体图谱；
[0017]图2为本专利技术的实施例的pSOY19
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ZM3转化株系T0代G10
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EPSPS基因的PCR鉴定结果图；
[0018]图3为本专利技术的实施例的pSOY19
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ZM3转化株系T0代G10
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EPSPS蛋白速测试纸条结果图；
[0019]图4为本专利技术的实施例的pSOY19
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ZM3转化株系T1代植株的G10
‑
EPSPS基因的PCR鉴定结果图。
具体实施方式
[0020]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本专利技术作进一步的详细说明，本专利技术的示意性实施方式及其说明仅用于解释本专利技术，并不作为对本专利技术的限定。
[0021]实施例：
[0022]本实施例首先构建了pSOY19
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ZM3载体，pSOY19
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ZM3载体可增加大豆抗除草剂能力且可降低大豆种子中抗除草剂蛋白含量，pSOY19
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ZM3载体可应用于增加大豆抗除草剂能力且降低大豆种子中抗除草剂蛋白含量的产品中。
[0023]本实施例首先对GmRCAβ基因的起始密码子上游2278bp的启动子序列进行PCR扩增，扩增引物如下：
[0024]PGmRCAβ
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F：
[0025]cccgggtaccgagctcGAATTCAGAGTCACAAACCTTTTCAACT，
[0026]PGmRCAβ
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R：
[0027]gagactggtgatGAATTCGGATGATGATGTCTTTGTGTTTG；得扩增的PGmRCAβ片段，PGmRCAβ的核苷酸序列见SEQ ID NO：1，备用；用EcoRI和NcoI双酶切除植物表达载体pSOY19载体中的35S启动子；然后将PGmRCAβ片段与切除了35S启动子的pSOY19载体相连，所用的连接酶为无缝组装的酶，购自于诺维赞公司，最终得pSOY19
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ZM3载体，pSOY19
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ZM3载体的核苷酸序列见SEQ ID NO：2。
[0028]pSOY19
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ZM3载体图谱见附图1，pSOY19
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ZM3载体从T
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DNA区域从右边界(T
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Border
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RB)到左边界(T
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Border
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LB)区域全长4615bp，该区域中除多克隆位点外主要由3个部分组成：1)能在植物中产生绿色组织特异表达的启动子(PGmRCAβ)，来自拟南芥的信号肽Ch
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L，该信号肽可引导其同一表达框编码的蛋白质转运至叶绿体内(序列如前所描述)；2)来自Deinococcus radiodurans R1的G10
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EPSPS耐草甘膦基因(序列如前所描述)，该基因序列与Ch
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L位于同一读码框；3)CaMV35S基因的终止子；LB和RB是T
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DNA的边界。pSOY19
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ZM3载体中各种元件的名称、大小和功能等信息见下表：
[0029]pSOY19
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ZM3载体中各种元件的信息表
[0030][0031][0032]为了验证pSOY19
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ZM3载体构建成功，本实施例将pSOY19
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ZM3载体通过冷激法转入农杆菌菌株LBA4404中，用携带有pSOY19
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ZM3载体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.pSOY19
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ZM3载体，其特征在于，pSOY19
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ZM3载体由绿色组织特异启动子PGmRCAβ和切除了35S启动子的pSOY19载体连接而成。2.权利要求1中的载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：对GmRCAβ基因的起始密码子上游2278bp的启动子序列进行PCR扩增，扩增引物如下：PGmRCAβ
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F：cccgggtaccgagctcGAATTCAGAGTCACAAACCTTTTCAACT，PG...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱佳美，李林，王守冬，徐恬恬，寿惠霞，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：