本发明专利技术涉及一种源自干酪乳杆菌的半乳糖变旋酶基因启动子及其用途，更具体而言，涉及一种具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的源自干酪乳杆菌的半乳糖变旋酶基因启动子，包含所述启动子的表达载体，以及用所述表达载体转化的微生物。用包含根据本发明专利技术的启动子的表达载体转化的微生物可以在细胞表面上有效表达靶蛋白，因此可用作疫苗载体等。此外，本发明专利技术涉及一种具有编码聚‑γ‑谷氨酸合成酶的基因pgsA的表面表达载体，以及一种使用所述载体在微生物表面上表达靶蛋白的方法。将含有插入其中的外源基因的载体转化到微生物中，并使外源蛋白能够在微生物表面上稳定表达。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用源自干酪乳杆菌的半乳糖变旋酶基因启动子用于组成型高表达的表面表达载体及其用途
本专利技术涉及一种源自干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)的半乳糖变旋酶基因启动子，更具体而言，涉及一种由SEQIDNO：1表示的源自干酪乳杆菌半乳糖变旋酶基因启动子，包含所述启动子的表达载体和经所述表达载体转化的微生物。此外，本专利技术涉及一种新载体，其使用源自芽孢杆菌(Bacillus·.)菌株并参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白(pgsA)在微生物表面上有效表达外源蛋白。而且，本专利技术涉及一种通过使用源自芽孢杆菌菌株并参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白在微生物表面上表达外源蛋白而产生蛋白质的方法。
技术介绍
乳酸菌是食品微生物中最重要的微生物，已获得GRAS(通常被认为是安全的)地位，因此已被用于多种食品中。这些乳酸菌具有质粒、噬菌粒、转座子等，因此使得可以开发用于将基因导入细胞中的载体。而且，这些乳酸菌易于根据本领域已知的常规方法进行转化，并且由于已经建立了可食用的选择性标记基因，因此被认为最适合用于可食用用途。另外，乳酸菌具有抑制有害的肠道细菌、清洁肠道、降低血液胆固醇水平、增加营养价值、抑制病原体感染和减轻肝硬化的作用，以及抗癌作用和通过巨噬细胞活化增强免疫系统的作用。为了在乳酸菌中产生有用的外源蛋白，必需建立高效的启动子(J.M.vanderVossenetal.，Appl.Environ.Microbial.，Vol.53，pp2452-2457，1987；TeijaKoivulaetal.，Appl.Environ.Microbial.，Vol.57，pp333-340，1991；PascalleG.G.A.etal.，Appl.Environ.Microbial.，Vol.62，pp3662-3667，1996)，但是对乳酸菌基因组的研究依然非常不足。在乳酸菌的基因组中，至今仅对长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)NCC2705、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)V583和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)WFCS1的基因组进行了测序，目前多种乳酸菌的基因组测序的研究正在进行中。另外，作为源自乳酸菌的启动子，目前仅已知源自嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)A054、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)MG1614和克氏乳球菌(Lactococcuscremoris)Wg2基因组的启动子(PhilippeSlosetal.，Appl.Environ.Microbial.，Vol.57，pp1333-1339，1991；TeijaKoivulaetal.，Appl.Environ.Microbial.，Vol.57，pp333-340，1991；J.M.vanderVossenetal.，Appl.Environ.Microbial.，Vol.53，pp2452-2457，1987)。近年来，在美国和欧洲，已经进行了以下研究：使用乳酸菌开发活疫苗；用于将有用的激素药物递送至肠道中的载体及为此建立有效的遗传资源；研发用于乳酸菌的插入载体。特别地，由于乳酸菌中包含的大量的未甲基化的CpGDNA、脂磷壁酸、肽聚糖等已知可作为免疫佐剂，因此，乳酸菌被认为是非常有用的疫苗载体。此外，乳酸菌具有的许多优势在于，由于乳酸菌对胆酸和胃酸具有抗性，因此可以将抗原递送至肠道中，并在肠道中诱导粘膜免疫(JosF.M.K.Seegers，TrendsBiotechnol.，Vol.20，pp508-515，2002)。然而，为了使用乳酸菌作为疫苗载体，必须开发一种通过将用于产生预防疾病抗体的抗原蛋白提呈至细胞内部或外部来促进抗原-抗体反应的技术。实际上，多种研究表明乳酸菌适合作为疫苗载体。这些研究包括证实其中表达人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)的L1蛋白的乳酸菌的抗体诱导能力(KarinaAraujoAiresetal.，Appl.Environ.Microbiol.Vol.72，pp745-752，2006)，以及证实分泌和表达IL-2(白细胞介素-2)的乳酸菌菌株的疾病治疗作用(LotharSteidleretal.，Nat.Biotechnol.Vol.21，pp785-789，2003)。如上所述，虽然已经积极地进行了表达靶蛋白的乳酸菌的多种应用的研发和乳酸菌的科学研究，但是仍然存在靶蛋白的表达水平不足的问题，以及当在活体内施用使用诱导型表达启动子获得的蛋白质时，蛋白质不能持续表达的问题。另外，细胞表面展示或细胞表面表达指的是将蛋白质或肽与适当的表面锚定基序融合并在革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌、真菌、酵母或动物细胞的表面上表达的技术(LeeS.Y.，etal.，TrendsBiotechnol.，21：4552，2003)。第一种细胞表面展示技术是在1980年代使用具有相对简单表面的噬菌体开发的，是一种将肽或小蛋白质与丝状噬菌体的pIII融合并表达的技术。因此，第一种细胞表面展示技术被称为表面表达系统。使用噬菌体的细胞表面展示已经用于筛选抗体、表位和高亲和力配体，但是具有可以在噬菌体表面展示的蛋白质的尺寸相对有限的局限性。因此，作为其替代方案，已经开发了使用细菌的细胞表面表达。这种细胞表面展示是一种通过使用诸如细菌或酵母的微生物的表面蛋白作为表面锚定基序在微生物表面上稳定表达外源蛋白的技术。为了使用特定生物体的外膜蛋白在细胞表面上表达外源蛋白，应该在基因水平将合适的表面蛋白和外源蛋白彼此连接以形成融合蛋白，并且所述融合蛋白应该稳定地穿过细胞内膜并应该附着并保持在细胞表面。为此，优选将具有以下特性的蛋白质用作表面锚定基序。即，(1)所述蛋白质在N末端具有能够通过细胞内膜的分泌信号；(2)所述蛋白质应该具有可稳定附着在细胞外膜上的靶向信号；(3)所述蛋白质可以在细胞表面在不会不利地影响细胞生长的范围内大量表达，从而可以表现出高活性；以及(4)所述蛋白质无论其尺寸如何应该能够稳定表达，从而可以用于多种反应中(Georgiouetal.，TIBTECH，11：6，1993)。此外，还需要对这种表面锚定基序进行基因工程，使得将其插入到宿主细胞表面上的外膜蛋白的N末端、C末端或中央部分(Leeetal.，TIBTECH，21：45-52，2003)。为了使蛋白质在细菌表面上表达，所述蛋白质应在其一级序列中具有使细胞中生物合成的蛋白质能够通过细胞膜的分泌信号。另外，在革兰氏阴性细菌的情况下，所述蛋白质应该穿过内细胞膜和细胞膜间隙，应该插入到并附着在外细胞膜上，并应该锚定在膜上以从膜向外突出。在细菌的情况下，这些用于将蛋白质锚定到细胞表面的具有分泌信号和靶向信号的蛋白质的例子包括表面蛋白、特定酶和毒素蛋白质。实际上，如果将这些蛋白质的分泌信号和靶向信号与适当的启动子一起使用，则所述蛋白质可以在细菌表面上成功表达。用于外源蛋白表面表达的细菌表面蛋白可以大致分为四种类型：外膜蛋白、脂本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种源自干酪乳杆菌的半乳糖变旋酶基因启动子。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181010 KR 10-2018-01205461.一种源自干酪乳杆菌的半乳糖变旋酶基因启动子。
2.根据权利要求1所述的启动子，其具有SEQIDNO：1的核苷酸序列。
3.一种表达载体，包含：权利要求1所述的启动子；和编码靶蛋白的基因。
4.一种用权利要求3所述的表达载体转化的微生物。
5.一种微生物表面表达载体，在所述微生物表面表达载体中，权利要求1所述的启动子、编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因和编码靶蛋白的基因彼此连接。
6.根据权利要求5所述的微生物表面表达载体，其中，所述靶蛋白是抗原。
7.根据权利要求5所述的微生物表面表达载体，其中，所述聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因是pgsA、pgsB和pgsC中的任意一种或更多种。
8.一种用权利要求5至7中任一项所述的微生物表面表达载体转化的微生物。
9.根据权利要求8所述的微生物，所述微生物是乳酸菌。
10.根据权利要求5所述的微生物表面表达载体，其中，所述编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因是pgsA，并且具有SEQIDNOs：18至21和29至31中任一项的核苷酸序列。
11.根据权利要求10所述的微生物表面表达载体，其中，基因pgsA源自产生聚-γ-谷氨酸的芽孢杆菌菌株。
12.根据权利要求10所述的微生物表面表达载体，其中，编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因pgsA具有SEQIDNO：22的核苷酸序列。
13.根据权利要求10所述的微生物表面表达载体，其中，接头被插入到基因pgsA的末端，并且所述编码靶蛋白的基因被插入到所插入的接头中。
14.根据权利要求10所述的微生物表面表达载体，其中，所述靶蛋白是该靶蛋白的氨基酸序列的一部分已经被去除或者以定点方式突变使得有利于表面表达的蛋白。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的微...
【专利技术属性】
技术研发人员：朴永铁，奇大殷，南坰骏，边世恩，文哈娜，姜显俊，咸京洙，
申请(专利权)人：生物领先公司，
类型：发明
国别省市：韩国;KR
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