一种使用DNA特征序列鉴定植物的方法技术

本发明专利技术公开了一种使用DNA特征序列鉴定植物的方法，通过检测植物的基因组中是否含有目标物种的DSS或其反向互补序列实现；目标物种的DSS为长度为20‑100bp、目标物种的核酸序列中存在且非目标物种的核酸序列中不存在的核酸序列片段。以白术DNA例，本发明专利技术能够将其从亲缘关系极近的其他苍术属植物中鉴定出来，弥补了之前的技术只能区分苍术和白术的不足。DSS不局限于基因组的特定区域，数据来源丰富，特异性好。本发明专利技术在鉴定药用植物中具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种使用DNA特征序列鉴定植物的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种使用DNA特征序列鉴定植物的方法。
技术介绍
DNA检测技术逐渐成为物种鉴定的首选技术。合适的变异速率、测序技术的发展以及日渐增多的核酸数据赋予了DNA检测技术的优势。现有DNA检测技术中，Hebert等人提出的DNA条形码技术(DNAbarcoding)是目前使用最为广泛的方法之一。DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。近年来，随着参考数据库(如BarcodeofLifeDataSystem，BOLD)数据量的增加、计算机算法的提升(如OverlapPER)以及相关研究的增多，DNA条形码的通用性和准确性都大大提高。DNA条形码技术最成功的应用案例莫过于使用细胞色素c氧化酶亚基I(cytochromecoxidasesubunitIgene，COI)基因片段对脊椎动物、昆虫和其他动物类群进行鉴定。然而不同于动物，DNA条形码技术在植物中的使用受到诸多限制。一方面是目前仍未在植物中发现通用的条形码区域。针对不同类型的植物往往需要使用不同的DNA条形码，这限制了植物DNA条形码技术的通用性。另一方面，现有的DNA条形码的鉴定成功率也不够理想。CBOL植物条形码工作组提出了以叶绿体基因rbcL和matK以及核基因组的内转录间隔区(InternalTranscribedSpacer，ITS)作为植物核心DNA条形码的方案。然而该方案在种水平的鉴定成功率不足80％，并且使用多个条形码协同鉴定物种的操作和分析过程十分繁琐(LiDZ，GaoLM，LiHT，etal.Comparativeanalysisofalargedatasetindicatesthatinternaltranscribedspacer(ITS)shouldbeincorporatedintothecorebarcodeforseedplants[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences，2011.)。基于上述原因，目前实际生产应用中多使用以特征性片段扩增区域(sequencecharacterizedamplifiedregion，SCAR)标记为代表的特异性鉴别方法。《中国药典》(2020版)中收录的DNA分子鉴定技术均基于SCAR标记。与基于通用引物扩增的DNA条形码标记相比，基于特异性引物的SCAR标记更加稳定、简便、高效，因而被广泛用于众多物种在种间或种内的高效鉴别上。然而传统的SCAR标记通常是由RAPD、SRAP、SSR标记等转化而来，使用上述类型标记向SCAR标记转化往往面临着开发周期长、工作量大等问题。因此，目前亟需一种能够高通量开发特异性标记的方法。DNA特征序列(DNAsignaturesequence，DSS)被定义为能够被用来检测某一物种是否出现且能够将其与其他所有物种分开的特定长度的核酸序列，即在给定的核酸序列范围内，只在待鉴定物种的核酸序列中出现的核酸序列片段。目前尚未出现利用DSS开发用于药用植物鉴定标记并用于药用植物鉴定的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是鉴定植物物种，尤其是药物植物的物种。本专利技术首先保护一种鉴定待测植物物种的方法，为检测待测植物的基因组中是否含有目标物种的DSS或其反向互补序列，进行如下判断：如果待测植物的基因组中含有目标物种的DSS或其反向互补序列，则待测植物的物种为或疑似为目标物种；如果待测植物的基因组中不含有目标物种的DSS或其反向互补序列，则待测植物的物种不为或疑似不为目标物种；所述目标物种的DSS为长度为20-100bp(如20-40bp、40-60bp、60-80bp、80-100bp、20bp、40bp、60bp、80bp或100bp)、目标物种的核酸序列中存在且非目标物种的核酸序列中不存在的核酸序列片段；获得目标物种的DSS的步骤依次如下：(1)从数据库下载或大量数据中分析获取若干个植物物种的基因组序列；(2)针对同一植物物种，从每个植物个体的基因组序列上的每个位点开始截取长度为30-50bp的序列片段；将所有个体产生的片段合并，进行100％相似度聚类，保留在所有个体中出现的序列片段，命名为物种的序列片段组合；(3)将若干个植物物种的序列片段组合合并，进行100％相似度聚类；如果某植物物种的某序列片段与其他植物物种的序列片段组合中的任一序列片段无法聚类，则该序列片段为该物种的DSS。上述方法中，所述基因组可为叶绿体基因组。上述方法中，所述检测待测植物的基因组中是否含有目标物种的DSS或其反向互补序列的方法可为A1)或A2)：A1)根据目标物种的DSS在基因组中的位置合成上游引物和下游引物组成的特异引物对，之后采用特异引物对对待测植物的基因组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；测序；A2)直接测序。上述方法中，所述植物可为药用植物。上述方法中，所述目标物种可为白术。所述白术的DSS可为DSS1、DSS2、DSS3、DSS4或DSS5；DSS1的核苷酸序列可如SEQIDNO:1所示；DSS2的核苷酸序列可如SEQIDNO:4所示；DSS3的核苷酸序列可如SEQIDNO:7所示；DSS4的核苷酸序列可如SEQIDNO:10所示；DSS5的核苷酸序列可如SEQIDNO:13所示。检测DSS1的特异引物对具体可为引物对1，由SEQIDNO:2所示的单链DNA分子和SEQIDNO:3所示的单链DNA分子组成。检测DSS2的特异引物对具体可为引物对2，由SEQIDNO:5所示的单链DNA分子和SEQIDNO:6所示的单链DNA分子组成。检测DSS3的特异引物对具体可为引物对3，由SEQIDNO:8所示的单链DNA分子和SEQIDNO:9所示的单链DNA分子组成。检测DSS4的特异引物对具体可为引物对4，由SEQIDNO:11所示的单链DNA分子和SEQIDNO:12所示的单链DNA分子组成。检测DSS5的特异引物对具体可为引物对5，由SEQIDNO:14所示的单链DNA分子和SEQIDNO:15所示的单链DNA分子组成。上述方法中，所述目标物种可为人参。所述人参的DSS可为DSS6、DSS7、DSS8或DSS9；DSS6的核苷酸序列可如SEQIDNO:16所示；DSS7的核苷酸序列可如SEQIDNO:19所示；DSS8的核苷酸序列可如SEQIDNO:22所示；DSS9的核苷酸序列可如SEQIDNO:25所示。检测DSS6的特异引物对具体可为引物对6，由SEQIDNO:17所示的单链DNA分子和SEQIDNO:18所示的单链DNA分子组成。检测DSS7的特异引物对具体可为引物对7，由SEQIDNO:20所示的单链DNA分子和SEQIDNO:21所示的单链DNA分子组成。检测DSS8的特异引物对具体可为引物对8，由SEQIDNO:23所示的单链DNA分子和SEQIDNO:24所示的单链DNA分子组成。检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定待测植物物种的方法，为检测待测植物的基因组中是否含有目标物种的DSS或其反向互补序列，进行如下判断：如果待测植物的基因组中含有目标物种的DSS或其反向互补序列，则待测植物的物种为或疑似为目标物种；如果待测植物的基因组中不含有目标物种的DSS或其反向互补序列，则待测植物的物种不为或疑似不为目标物种；/n所述目标物种的DSS为长度为20-100bp、目标物种的核酸序列中存在且非目标物种的核酸序列中不存在的核酸序列片段；/n获得目标物种的DSS的步骤依次如下：/n(1)从数据库下载或大量数据中分析获取若干个植物物种的基因组序列；/n(2)针对同一植物物种，从每个植物个体的基因组序列上的每个位点开始截取长度为30-50bp的序列片段；将所有个体产生的片段合并，进行100％相似度聚类，保留在所有个体中出现的序列片段，命名为物种的序列片段组合；/n(3)将若干个植物物种的序列片段组合合并，进行100％相似度聚类；如果某植物物种的某序列片段与其他植物物种的序列片段组合中的任一序列片段无法聚类，则该序列片段为该物种的DSS。/n

【技术特征摘要】
1.一种鉴定待测植物物种的方法，为检测待测植物的基因组中是否含有目标物种的DSS或其反向互补序列，进行如下判断：如果待测植物的基因组中含有目标物种的DSS或其反向互补序列，则待测植物的物种为或疑似为目标物种；如果待测植物的基因组中不含有目标物种的DSS或其反向互补序列，则待测植物的物种不为或疑似不为目标物种；
所述目标物种的DSS为长度为20-100bp、目标物种的核酸序列中存在且非目标物种的核酸序列中不存在的核酸序列片段；
获得目标物种的DSS的步骤依次如下：
(1)从数据库下载或大量数据中分析获取若干个植物物种的基因组序列；
(2)针对同一植物物种，从每个植物个体的基因组序列上的每个位点开始截取长度为30-50bp的序列片段；将所有个体产生的片段合并，进行100％相似度聚类，保留在所有个体中出现的序列片段，命名为物种的序列片段组合；
(3)将若干个植物物种的序列片段组合合并，进行100％相似度聚类；如果某植物物种的某序列片段与其他植物物种的序列片段组合中的任一序列片段无法聚类，则该序列片段为该物种的DSS。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测待测植物的基因组中是否含有目标物种的DSS或其反向互补序列的方法为A1)或A2)：
A1)根据目标物种的DSS在基因组中的位置合成上游引物和下游引物组成的特异引物对，之后采用特异引物对对待测植物的基因组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；测序；
A2)直接测序。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述目标物种为白术。


4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述白术的DSS为DSS1、DSS2、DSS3、DSS4或DSS5；
DSS1的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；
DSS2的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；
DSS3的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示；
DSS4的核苷酸序列如SEQIDNO:10所示；
DSS5的核苷酸序列如SEQIDNO:13所示。


5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：
检测DSS1的特异引物对为引物对1，由SEQIDNO:2所示的单链DNA分子和SEQIDNO:3所示的单链DNA分子组成；
检测DSS2的特异引物对为引物对2，由SEQIDNO:5所示的单链DNA分子和SEQIDNO:6所示的单链DNA分子组成；
检测DSS3的特异引物对为引物对3，由SEQIDNO:8所示的单链DNA分子和SEQIDNO:9所示的单链DNA分子组成；
检测DSS4的特异引物对为引物对4，由SEQIDNO:11所示的单链DNA分子和SEQIDNO:12所示的单链DNA分子组成；
检测DSS5的特异引物对为引物对5，由SEQIDNO:14所示的单链DNA分子和SEQIDNO:15所示的单链DNA分子组成。


6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述目标物种为人参。


7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述人参的DSS为DSS6、DSS7、DSS8或DSS9；
DSS6的核苷酸序列如SEQIDNO:16所示；
DSS7的核苷酸序列如SEQIDNO:19所示；
DSS8的核苷酸序列如SEQIDNO:22所示；
DSS9的核苷酸序列如SEQIDNO:25所示。


8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：
检测DSS6的特异引物对为引物对6，由SEQIDNO:17所示的单链DNA分子和SEQIDNO:18所示的单链DNA分子组成；
检测DSS7的...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁媛，华中一，蒋超，黄璐琦，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11