一种绵羊PER2基因插入/缺失多态性的检测方法、试剂盒和应用技术

本发明专利技术公开了一种绵羊PER2基因插入/缺失多态性的检测方法，包括以下步骤：以待测绵羊基因组DNA为模板，利用PCR扩增包含绵羊PER2基因外显子区插入/缺失多态性位点，将扩增产物进行电泳分型，根据电泳结果鉴定对应插入/缺失多态性位点的基因型；所述插入/缺失多态性位点选自绵羊PER2基因NC_040252.1:g.2899558‑2899563位6‑bpindel多态性位点。本发明专利技术方法根据绵羊PER2基因外显子区插入/缺失多态性位点设计引物，以绵羊基因组DNA为模板，通过序列扩增、电泳鉴定，能够简便、精确、低成本地检测所述插入/缺失多态性位点的基因型。

【技术实现步骤摘要】
一种绵羊PER2基因插入/缺失多态性的检测方法、试剂盒和应用
本专利技术属于生物技术与家畜育种
，尤其是一种绵羊PER2基因插入/缺失(indel)多态性的检测方法、试剂盒和应用。
技术介绍
绵羊作为最早被人类驯化的动物之一，在畜牧产业中具有重要的经济价值，可以为人们提供羊肉、羊奶、羊绒、羊皮等一系列动物副产品。我国是绵羊饲养量、出栏量及羊肉产出量最多的国家，绵羊的繁殖性状直接影响养殖企业的生产效益。现代绵羊育种旨在提高其生产和繁殖性能从而大大提高其经济价值。随着生物科学技术的发展以及遗传学研究的深入，传统的选择方法逐渐暴露出周期长、难度大等弊端，已不能满足我国绵羊育种能力快速提高的需要。近年来，分子标记辅助选择(Marker-assistedSelection，MAS)在动物育种中广为应用，可以显著提高选择的准确性和选择效率。分子标记辅助选择可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种。目前，常见的基因组变异包括插入/缺失(indel)、单核苷酸多态性(SNPs)和结构变异(SVs)等。Indel突变是作为一种重要的分子遗传标记具有分布广、密度高、数量多、检测方便等优点。且与其它变异相比，indel更容易通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳技术直接被鉴定。随着比较基因组学的深入研究，indel为理论研究和遗传育种应用研究提供了大量的生物信息，其作为遗传学鉴定标记，多集中在人类基因组研究中，对反刍家畜的功能性基因，尤其是可应用于反刍动物繁殖性状的选育方面的indel标记的研究和应用甚少。最近的研究显示，孙等人的研究发现绵羊BMPR-IB基因编码区存在一个597位点与绵羊产羔数有关(孙渭博,2020)；Chen等在绵羊PPARGC1A基因上检测到一个17bp的indel与绵羊生长性状显著相关(ChenPingbo，2020)；Akhatayeva等利用indel分子标记在绵羊GHR和PRL基因上发现3个与产羔数有关的indel位点(Akhatayevaetal.，2020)，从而加快绵羊分子选育。这些研究都表明indels对动物分子育种具有重要的意义和参考价值。周期2(period2,PER2)是编码生物钟的特殊成分，其主要功能是调节昼夜节律，该基因是周期基因家族的成员，在视交叉上核中以昼夜节律模式表达，视交叉上核是哺乳动物大脑中主要的昼夜节律起搏器。这个家族中的基因编码运动活动、代谢和行为的昼夜节律的组成部分，从而调节生物的许多生化、生理和行为过程。该基因由CLOCK/ARNTL异二聚体上调，但随后在使用PER/CRY异二聚体与CLOCK/ARNTL相互作用的反馈回路中抑制这种上调。这种基因的多态性可能会增加患某些癌症的风险，并与睡眠障碍有关。近年来，相关研究表明，PER2的表达与绵羊繁殖激素的分泌有关，如雌激素、黄体生成素等。据报道，动物繁殖激素分泌情况会影响动物的发情周期，从而影响动物的生殖能力。然而，目前还没有相关研究证实PER2基因通过影响绵羊发情周期来调节生殖相关功能。因此，PER2基因多态性影响绵羊产羔数的机制有待进一步研究。基于此，本专利技术PER2基因可以作为改善绵羊繁殖性能的候选基因，研究其关键变异位点与绵羊性状的关系，加速培育繁殖性能优良的绵羊品种。通过检索，尚未发现与本专利技术专利申请相关的专利公开文献。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种绵羊PER2基因插入/缺失(indel)多态性的检测方法、试剂盒和应用。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种绵羊PER2基因插入/缺失多态性的检测方法，包括以下步骤：以待测绵羊基因组DNA为模板，利用PCR扩增包含绵羊PER2基因外显子区插入/缺失多态性位点，将扩增产物进行电泳分型，根据电泳结果鉴定对应插入/缺失多态性位点的基因型；所述插入/缺失多态性位点选自绵羊PER2基因NC_040252.1:g.2899558-2899563位6-bpindel多态性位点。进一步地，所述插入/缺失多态性位点PER2采用的PCR扩增引物对为：上游引物：SEQNO.15’-GTCTTAAAGGCAGCAGCGAC-3’(20nt)，下游引物：SEQNO.25’-TGTCGGCCATCAGCAGC-3’(17nt)。进一步地，所述PCR采用的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸20s，25个循环；72℃延伸10min；所述电泳采用质量浓度为3.5％的琼脂糖凝胶。进一步地，根据电泳结果，插入/缺失多态性位点有两个基因型II和ID，其中插入/插入基因型II表现为162bp一条带纹，插入/缺失基因型ID表现为162bp和大于162bp的两条带纹。进一步地，所述绵羊为澳洲白绵羊或兰州大尾羊。如上所述的检测方法在绵羊育种的分子标记辅助方面中的应用。绵羊PER2基因NC_040252.1:g.2899558-2899563位6-bp插入/缺失多态性位点在绵羊育种的分子标记辅助方面中的应用。一种绵羊PER2基因插入/缺失多态性的检测试剂盒，所述试剂盒包含用于PCR扩增绵羊PER2基因NC_040252.1:g.2899558-2899563位6-bp插入/缺失多态性位点的引物对。进一步地，所述引物对为：上游引物：SEQNO.15’-GTCTTAAAGGCAGCAGCGAC-3’(20nt)，下游引物：SEQNO.25’-TGTCGGCCATCAGCAGC-3’(17nt)。如上所述的检测试剂盒在绵羊育种的分子标记辅助方面中的应用。本专利技术取得的优点和积极效果为：1、本专利技术方法根据绵羊PER2基因外显子区插入/缺失多态性位点(参考序列NC_040252.1:g.2899558-2899563)设计引物，以绵羊基因组DNA为模板，通过序列扩增、电泳鉴定，能够简便、精确、低成本地检测所述插入/缺失多态性位点的基因型。2、本专利技术方法对澳洲白绵羊和兰州大尾羊PER2基因6-bp插入/缺失多态性位点(参考序列NC_040252.1:g.2899558-2899563)进行基因型和基因频率分析，对该插入/缺失多态性位点与澳洲白绵羊繁殖性状进行独立卡方检验，结果表明本专利技术检测的插入/缺失多态性位点即PER2基因6-bpindel位点能够作为绵羊产羔数的分子标记位点，从而加快建立繁殖性状优良的绵羊种群，提高良种选育速度。3、本专利技术方法以待测绵羊全基因组DNA为模板，通过PCR扩增绵羊PER2基因部分片段，再进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定绵羊PER2基因NC_040252.1:g.2899558-2899563位6-bp插入/缺失多态性位点的基因型。PER2基因6-bpindel多态性对产羔数有显著影响，存在提高绵羊繁殖性状的DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种绵羊PER2基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：/n以待测绵羊基因组DNA为模板，利用PCR扩增包含绵羊PER2基因外显子区插入/缺失多态性位点，将扩增产物进行电泳分型，根据电泳结果鉴定对应插入/缺失多态性位点的基因型；所述插入/缺失多态性位点选自绵羊PER2基因NC_040252.1:g.2899558-2899563位6-bpindel多态性位点。/n

【技术特征摘要】
1.一种绵羊PER2基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
以待测绵羊基因组DNA为模板，利用PCR扩增包含绵羊PER2基因外显子区插入/缺失多态性位点，将扩增产物进行电泳分型，根据电泳结果鉴定对应插入/缺失多态性位点的基因型；所述插入/缺失多态性位点选自绵羊PER2基因NC_040252.1:g.2899558-2899563位6-bpindel多态性位点。


2.根据权利要求1所述的绵羊PER2基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述插入/缺失多态性位点PER2采用的PCR扩增引物对为：
上游引物：SEQNO.1；
下游引物：SEQNO.2。


3.根据权利要求1所述的绵羊PER2基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述PCR采用的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸20s，25个循环；72℃延伸10min；所述电泳采用质量浓度为3.5％的琼脂糖凝胶。


4.根据权利要求1至3任一项所述的绵羊PER2基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：根...

【专利技术属性】
技术研发人员：张清峰，黄洋铭，张东杰，王春智，苏鹏，潘传英，蓝贤勇，王力，林春建，徐红伟，
申请(专利权)人：天津奥群牧业有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12