建立实时荧光定量检测PER2启动子甲基化水平的方法技术

本发明专利技术公开了一种建立实时荧光定量检测PER2启动子甲基化水平的方法，其包括如下步骤：S1.选择PER2启动子CpG岛区域：1)根据基因数据库查询到PER2启动子序列；2)通过CpG岛在线预测网站预测PER2启动子序列所包含的GpG岛富集区并确定目标序列；S2.根据目标序列设计PER2启动子甲基化检测的引物和探针；S3.根据重亚硫酸盐对基因序列的转化规律设计目标序列甲基化和非甲基化序列，并人工合成相应序列，以质粒形式保存；S4.实时荧光定量PCR检测PER2启动子甲基化方法的建立及性能确认。通过本发明专利技术可以精确定量检测PER2启动子甲基化水平，为研究PER2甲基化提供有效的工具和方法。

【技术实现步骤摘要】
建立实时荧光定量检测PER2启动子甲基化水平的方法
本专利技术涉及PER2启动子甲基化水平检测
，具体涉及一种建立实时荧光定量检测PER2启动子甲基化水平的方法。
技术介绍
许多研究证明白血病尤其是髓系白血病患者PER2基因会发生高甲基化，PER2甲基化可能是白血病早期诊断、预后和治疗的重要表观遗传标记。目前有关PER2启动子甲基化检测多采用的是甲基化特异性MSP法，是一种定性检测方法，不易用于动态监测和水平的比较。目前尚未有经过严格性能确认的PER2基因启动子甲基化定量检测的方法，也没有可用于定量检测PER2启动子甲基化水平的参考物质。HPeng(PMID:31031806)，MPienkowska(PMID:31409384)等采用亚硫酸盐焦磷酸测序法检测PER2启动子甲基化。但是该亚硫酸盐焦磷酸测序法成本较高。FHernandez-Rosas(PMID:30008892)等采用甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测PER2启动子甲基化，但该方法只能定性检测，无法做到精确定量，也无法动态检测甲基化水平的变化。
技术实现思路
有鉴于此，为解决上述技术问题，本专利技术的目的在于建立一种可靠稳定的基于Taqman探针的检测PER2基因启动子甲基化水平的实时荧光定量MSP方法，即一种建立实时荧光定量检测PER2启动子甲基化水平的方法。所采用的技术方案为：一种建立实时荧光定量检测PER2启动子甲基化水平的方法，包括如下步骤：S1.选择PER2启动子CpG岛区域：1)根据基因数据库查询到PER2启动子序列；2)通过CpG岛在线预测网站预测PER2启动子序列所包含的GpG岛富集区并确定目标序列；S2.根据目标序列设计PER2启动子甲基化检测的引物和探针；S3.根据重亚硫酸盐对基因序列的转化规律设计目标序列甲基化和非甲基化序列，并人工合成相应序列，以质粒形式保存；S4.实时荧光定量PCR检测PER2启动子甲基化方法的建立及性能确认：筛选合适的引物，并选择引物探针组合，以相应质粒为模板，对检测方法的性能进行评价，从而确认建立的方法的检测性能。进一步地，S4中，对检测方法的性能进行评价包括对检测方法的灵敏度、特异度、准确度和扩增效率的各性能进行评价。进一步地，S4中，对检测方法的性能进行评价中，模拟参考物质的拷贝浓度计算方法如下：质粒DNA的浓度为20ng/uL。质粒浓度换算为拷贝数计算公式：拷贝数(拷贝/μL)＝(质粒浓度ng/μL×10-9)×(6.02×1023)/(质粒碱基数×660)，依此公式计算的到质粒拷贝数为6×109copies/uL；然后将质粒MSP-5进行连续10倍倍比稀释至0.6copies/uL。进一步地，S1中，查询到PER2启动子序列如SEQIDNO：1。进一步地，S1中，确定目标序列如SEQIDNO：2。进一步地，S3中，人工合成相应序列是分别设计该序列的甲基化和未甲基化后经亚硫酸氢化学修饰后的序列，分别作为阳性参考物质MSP-5和阴性参考物质MSP-6。进一步地，S3中，将MSP-5与MSP-6分别与pUC57载体连接，然后转化至大肠埃希菌Top10感受态细胞，37℃振荡培养1h，涂布于Amp+琼脂平板上，筛选阳性克隆并扩大培养，分别用甲基化引物和非甲基化引物对MSP-5和MSP-6进行菌液PCR鉴定，甲基化引物序列如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4，非甲基化引物序列如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6。进一步地，S3中，MSP-5序列如SEQIDNO：7，MSP-6序列如SEQIDNO：8。进一步地，MSP-5与pUC57载体连接后的序列如SEQIDNO：9，MSP-6分别与pUC57载体连接后的序列如SEQIDNO：10。进一步地，S4中，引物为一对引物，序列如SEQIDNO：11和SEQIDNO：12，探针为一条探针，序列为SEQIDNO：13。本专利技术的有益效果在于：通过本专利技术可以精确定量检测PER2启动子甲基化水平，为研究PER2甲基化提供有效的工具和方法。附图说明图1为目标序列的CpG岛分布情况图。图2为目的基因(目标序列)的PCR扩增实验结果图。图中，M：DNAmarker；1：MSP-5；2：MSP-6；3：空白对照。图3为普通MSP方法的检测下限实验结果图。图中，M:DNAMarker.Labels1-9:6×107copies/uL,6×106copies/uL,6×105copies/uL,6×104copies/uL,6×103copies/uL,6×102copies/uL,6×10copies/uL,6copies/uL,MSP-6.图4为实时荧光定量MSP方法的检测下限实验结果图。图中，1-9:6×107copies/uL,6×106copies/uL,6×105copies/uL,6×104copies/uL,6×103copies/uL,6×102copies/uL,6×10copies/uL,6copies/uL,MSP-6.图5为Taqman实时荧光定量MSP方法的特异性实验结果图。图6为扩增反应的标准曲线图。具体实施方式下面的实施例是本专利技术说明性优选实施方案，对本专利技术不构成任何限制。本专利技术的一种建立实时荧光定量检测PER2启动子甲基化水平的方法，是一种基于Taqman探针建立的实时荧光定量PCR检测PER2启动子甲基化水平方法，包括如下步骤：S1.选择PER2启动子CpG岛区域：1)根据基因数据库Genebank查询到PER2启动子序列；PER2启动子序列(一般认为基因上游2kb区域为该基因的promoter区域，所以选择基因上游2kb序列，每个基因会有多个启动子序列，本方法是针对第一个启动子序列进行的研究)：Homosapiensperiodcircadianregulator2(PER2),RefSeqGeneonchromosome2,SequenceID:NG_012146.1:3465to5464具体的，该PER2启动子序列如SEQIDNO：1。2)通过CpG岛在线预测网站预测PER2启动子序列所包含的GpG岛富集区并确定目标序列；PER2选择的富含CpG岛的目标序列(Homosapiensperiodcircadianregulator2(PER2),RefSeqGeneonchromosome2,SequenceID:NG_012146.1:4857-5156)具体的如SEQIDNO：2。其中目标序列的CpG岛分布情况图如图1所示。S2.根据目标序列设计PER2启动子甲基化检测的引物和探针；S3.根据重亚硫酸盐对基因序列的转化规律设计目标序列甲基化和非甲基化序列，并人工合成相应序列，以质粒形式保存；其中人工合成相应序列作为阳性和阴性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种建立实时荧光定量检测PER2启动子甲基化水平的方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1.选择PER2启动子CpG岛区域：/n1)根据基因数据库查询到PER2启动子序列；/n2)通过CpG岛在线预测网站预测PER2启动子序列所包含的GpG岛富集区并确定目标序列；/nS2.根据目标序列设计PER2启动子甲基化检测的引物和探针；/nS3.根据重亚硫酸盐对基因序列的转化规律设计目标序列甲基化和非甲基化序列，并人工合成相应序列，以质粒形式保存；/nS4.实时荧光定量PCR检测PER2启动子甲基化方法的建立及性能确认：筛选合适的引物，并选择引物探针组合，以相应质粒为模板，对检测方法的性能进行评价，从而确认建立的方法的检测性能。/n

【技术特征摘要】
1.一种建立实时荧光定量检测PER2启动子甲基化水平的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.选择PER2启动子CpG岛区域：
1)根据基因数据库查询到PER2启动子序列；
2)通过CpG岛在线预测网站预测PER2启动子序列所包含的GpG岛富集区并确定目标序列；
S2.根据目标序列设计PER2启动子甲基化检测的引物和探针；
S3.根据重亚硫酸盐对基因序列的转化规律设计目标序列甲基化和非甲基化序列，并人工合成相应序列，以质粒形式保存；
S4.实时荧光定量PCR检测PER2启动子甲基化方法的建立及性能确认：筛选合适的引物，并选择引物探针组合，以相应质粒为模板，对检测方法的性能进行评价，从而确认建立的方法的检测性能。


2.根据权利要求1所述的建立实时荧光定量检测PER2启动子甲基化水平的方法，其特征在于，S4中，对检测方法的性能进行评价包括对检测方法的灵敏度、特异度、准确度和扩增效率的各性能进行评价。


3.根据权利要求2所述的建立实时荧光定量检测PER2启动子甲基化水平的方法，其特征在于，S4中，对检测方法的性能进行评价中，模拟参考物质的拷贝浓度计算方法如下：质粒DNA的浓度为20ng/uL。质粒浓度换算为拷贝数计算公式：拷贝数(拷贝/μL)＝(质粒浓度ng/μL×10-9)×(6.02×1023)/(质粒碱基数×660)，依此公式计算的到质粒拷贝数为6×109copies/uL；然后将质粒MSP-5进行连续10倍倍比稀释至0.6copies/uL。


4.根据权利要求1所述的建立实时荧光定量检测PER2启动子甲基化水平的方法，其特征在于，S1中，查询到PER2启动子序列如SEQIDNO：1。

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【专利技术属性】
技术研发人员：孙成铭，杨新，姜慧慧，彭绒雪，孙茁凯，刘杰，杜江东，孙枝红，
申请(专利权)人：孙成铭，杨新，
类型：发明
国别省市：山东;37