新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗及其制备方法与应用，该载体中含有SEQ ID NO.1所示序列。本发明专利技术是基于复制缺陷型Ad26载体，可避免载体被人体内预存抗体中和，免疫效果高于常规的Ad5载体疫苗；而且，Ad26复制能力高于Ad5，从而可以在同等时间内获得更多的载体，疫苗制备成本更低。而且基于SEQ ID NO.1制备得到的疫苗的免疫原性也会大大提高。本发明专利技术中的载体制备方法操作步骤简单易行，具有极高的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗及其制备方法与应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗及其制备方法与应用。
技术介绍
冠状病毒(Coronavirus)在病毒学分类上属于巢状病毒目(orderNidovirals)、冠状病毒科(familyCoronavirade)、冠状病毒属(genusCoronavirus)的成员，基因组为单股、正链的RNA，基因组全长在26～32kb之间，是目前已知基因组最大的RNA病毒。人冠状病毒目前已知有六种，分别是二十世纪60年代发现的人冠状病毒229E(HCoV-229E)和HCoV-OC43，2003年出现的SARS-CoV，2004年在荷兰分离的HCoV-NL63，2005年在中国香港鉴定的HCoV-HKU1以及2012年在中东地区出现的新型中东呼吸综合征(MiddleEastrespiratorysyndromevirus，MERS)冠状病毒MERS-CoV。冠状病毒能够感染机体的呼吸道、消化道、肝脏、肾脏以及神经系统，造成不同程度的病理性损伤，严重者甚至造成死亡。在SARS-CoV-2冠状病毒的病毒颗粒结构中，S蛋白(spikeprotein,Sprotein)是一个十分重要的靶点。SARS-CoV-2冠状病毒的S蛋白存在融合前构象和融合后构象，其会识别细胞膜上受体蛋白ACE2(angiotensinconvertingenzyme2)，通过宿主细胞的弗林蛋白酶进行切割，使蛋白分为S1和S2，进而介导并促使病毒包膜与细胞膜发生融合，融合后产生的抗体多为结合抗体，没有中和作用，使疫苗免疫原性大打折扣。相关技术中，采用的新型冠状病毒的刺突蛋白S基因(序列号NC_045512.2)作为靶序列，但该基因在人肾细胞HEK293表达水平很低，通过其制备得到的疫苗可能无效或是效价很低，不足以抵抗病毒的感染。因此，开发一种有效且高效的新型冠状病毒疫苗对于新型冠状病毒的防治与控制具有极为重要的意义。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗，该疫苗采用人Ad26型腺病毒载体，解决了人体内Ad5预存抗体水平高的难题，提高了疫苗免疫效果，扩大了适应人群。本专利技术的第一个方面，提供一种新型冠状病毒Ad26腺病毒载体，该Ad26腺病毒载体负载有新冠病毒Spikes优化序列。真核细胞转录的mRNA前体能够通过不同剪接方式(选择不同的剪接位点组合)产生不同的mRNA剪接异构体的过程，最终导致同一个基因序列产生的不同的蛋白质，这对蛋白的表达是非常不利的。专利技术人通过对野生型的天然核酸序列(新冠病毒Spikes蛋白)进行密码子优化，同时基于自有技术去除潜在的可变剪切位点，保证了新冠病毒Spikes蛋白表达的唯一性，减少了蛋白后续纯化的难度。本专利技术通过将密码子优化后，S基因的弗林蛋白酶切位点发生突变(RRAR突变为GSAS)，同时在S基因的986aa～987aa的KV突变为PP，使S蛋白维持稳定的融合前构象，大大提升了疫苗的免疫原性。将突变后的S基因整合到复制缺陷型Ad26载体上，通过腺病毒感染细胞，呈递新冠病毒抗原，免疫后使机体产生特异性免疫反应，从而阻断新冠病毒的感染。根据本专利技术的第一个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述新冠病毒Spikes优化序列如SEQIDNO.1所示。根据本专利技术的第一个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述Ad26腺病毒载体为复制缺陷型Ad26腺病毒载体。在本专利技术的一些更优选实施方式中，所述复制缺陷型Ad26腺病毒载体为缺失E1和E3区基因的复制缺陷型Ad26腺病毒载体根据本专利技术的第一个方面，在本专利技术的一些实施方式中，外源基因启动子选自人巨细胞病毒CMV启动子、鼠巨细胞病毒CMV启动子、EF1a或PGK1中的至少一种。在本专利技术的一些优选实施方式中，外源基因启动子选自人巨细胞病毒CMV启动子或、鼠巨细胞病毒CMV启动子。根据本专利技术的第一个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述Ad26腺病毒载体可以调控SEQIDNO：1所示核酸序列的表达。本专利技术的第二个方面，提供一种新型冠状病毒Ad26腺病毒载体的制备方法，包括如下步骤：(1)扩增SEQIDNO.1所示序列，重组构建穿梭质粒1；(2)扩增穿梭质粒1基因组，重组构建穿梭质粒2；(3)扩增穿梭质粒2基因组，重组构建穿梭质粒3；(4)扩增穿梭质粒3基因组，得到目的片段CMV-SPd-BGH，将目的片段CMV-SPd-BGH与去除E1和E3基因的pAd26质粒共转染至细胞中，即得新型冠状病毒Ad26腺病毒载体。本专利技术的第三个方面，提供一种新型冠状病毒Ad26腺病毒疫苗，该疫苗包括本专利技术第一个方面所述载体或本专利技术第二个方面所述制备方法制备得到的载体。本专利技术是基于复制缺陷型Ad26载体的新冠疫苗，Ad26在人群中预存抗体的比例低于Ad5，因此，基于复制缺陷型Ad26载体的新冠疫苗可避免载体被人体内预存抗体中和，免疫效果高于Ad5载体疫苗。而且，Ad26复制能力高于Ad5。因此，在疫苗生产方面，Ad26载体疫苗的成本有望低于Ad5载体疫苗。根据本专利技术的第三个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述新型冠状病毒Ad26腺病毒载体可在人源细胞或人体内表达蛋白。在本专利技术的一些优选实施方式中，所述蛋白可在人体内：诱导免疫应答；或产生生物报告分子；或用于检测的追踪分子；或调节基因功能；或作为治疗性分子。在本专利技术的一些优选实施方式中，所述的疫苗为DNA质粒或RNA表达质粒。可在本专利技术中的新型冠状病毒Ad26腺病毒载体中加入EGFP、SEAP、shRNA等基团或基因，从而使其获得诱导免疫应答；或产生生物报告分子；或用于检测的追踪分子；或调节基因功能；或作为治疗性分子的作用。根据本专利技术的第三个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗中还包括药学上可接受的免疫调节剂、载体、稀释剂、赋形剂或至少一种对COVID-19有治疗作用的药物。本专利技术的有益效果是：1.本专利技术是基于复制缺陷型Ad26载体，由于Ad26在人群中预存抗体的比例低于Ad5，因此可避免载体被人体内预存抗体中和，免疫效果高于常规的Ad5载体疫苗；而且，Ad26复制能力高于Ad5，从而可以在同等时间内获得更多的载体，疫苗制备成本更低。2.本专利技术中的疫苗是基于密码子优化后的S基因制备得到的，由于密码子优化后的S基因的弗林蛋白酶切位点突变，以及986aa～987aa的KV突变为PP，使S蛋白维持稳定的融合前构象，大大提升了疫苗的免疫原性。3.本专利技术中的载体制备方法操作步骤简单易行，仅通过PCR扩增即可获得新型冠状病毒Ad26腺病毒载体，有效节约了人工成本。附图说明图1为本专利技术实施例中的新型冠状病毒Ad26腺病毒载体的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型冠状病毒Ad26腺病毒载体，其特征在于，所述Ad26腺病毒载体负载有新冠病毒Spikes优化序列；所述新冠病毒Spikes优化序列优选为如SEQ ID NO.1所示序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒Ad26腺病毒载体，其特征在于，所述Ad26腺病毒载体负载有新冠病毒Spikes优化序列；所述新冠病毒Spikes优化序列优选为如SEQIDNO.1所示序列。


2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒Ad26腺病毒载体，其特征在于，所述Ad26腺病毒载体为复制缺陷型Ad26腺病毒载体。


3.根据权利要求2所述的腺病毒载体疫苗，其特征在于：所述复制缺陷型Ad26腺病毒载体为缺失E1和E3区基因的复制缺陷型Ad26腺病毒载体。


4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒Ad26腺病毒载体，其特征在于，外源基因启动子选自人巨细胞病毒CMV启动子、鼠巨细胞病毒CMV启动子、EF1a或PGK1中的至少一种。


5.根据权利要求1-4任一项所述的新型冠状病毒Ad26腺病毒载体，其特征在于，所述Ad26腺病毒载体可以调控SEQIDNO：1所示核酸序列的表达。


6.一种新型冠状病毒Ad26腺病毒载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)扩增SEQIDNO.1所示序列，重组构建穿梭质粒1；
(2)扩增穿梭质粒1基因组，重组构建穿梭质粒2；
(3)扩增穿梭质粒2基因组，重组构建穿梭质粒3；
(4)扩增穿梭质粒3...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈凌，杨臣臣，关素华，汪乾，
申请(专利权)人：广州恩宝生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44