靶向敲除ARID1A基因的sgRNA、构建ARID1A基因缺失细胞株的方法及应用技术

本发明专利技术公开了靶向敲除ARID1A基因的sgRNA、构建ARID1A基因缺失细胞株的方法及应用，属于生物医药技术领域。通过构建重组慢病毒质粒ARID1A sgRNA‑lentiCRISPR v2、将CRISPR/Cas9慢病毒系统通过293T细胞进行包装获得慢病毒颗粒、将慢病毒颗粒感染目的细胞株、有限稀释法传代筛选，可获得稳定的ARID1A基因敲除的细胞株。Western blot蛋白表达检测显示，基因敲除的细胞株ARID1A蛋白表达完全缺失。另外，ARID1A基因敲除的细胞株增殖能力明显增强。结果表明，利用CRISPR/Cas9慢病毒系统成功敲除ARID1A基因后，可促使胃上皮细胞的恶性转化。

【技术实现步骤摘要】
靶向敲除ARID1A基因的sgRNA、构建ARID1A基因缺失细胞株的方法及应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种敲除ARID1A基因的sgRNA、构建ARID1A基因缺失细胞株的方法及应用。
技术介绍
ARID1A(AT-richinteractivedomain-containingprotein1A)基因位于人第1号染色体1p35.3，长约86kb，包含20个外显子，编码一个定位于细胞核、相对分子量约为240kDa的蛋白。ARID1A蛋白是SWI/SNF染色质重塑复合物的重要组成亚基，参与染色质重塑，如DNA的复制、转录和损伤修复等过程，是细胞核活动的关键成员，调控基因的表达。新近研究发现，染色质重塑复合物分子基因型的改变是肿瘤发生发展的新机制。ARID1A突变缺失导致的染色质重塑异常进而引起基因表达调节紊乱，与多种肿瘤的发生发展密切相关。基因组测序研究显示：在胃癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌等多种恶性肿瘤中均存在高频的ARID1A突变。但ARID1A突变缺失后，促进肿瘤发生发展的具体分子机制尚未明确。胃癌位居世界恶性肿瘤发病率的第五位，死亡率的第三位。晚期胃癌患者五年生存率低于30％，而目前仍缺乏有效的治疗方案。因此，深入研究胃癌发生发展的分子机制，对探索胃癌诊治的新靶点、促进精准医疗具有重要意义。既往研究多采用RNA干扰技术研究胃癌相关基因。然而，RNA干扰只能低效率的敲低基因的表达，并不能实现基因的突变缺失，限制了ARID1A突变缺失在胃癌中的分子机制的研究。CRISPR/Cas9系统是细菌和古生菌等原核生物在进化过程中，抵抗噬菌体或质粒等外源DNA入侵的一种获得性免疫防御系统，也是一种由RNA介导的核酸内切酶系统。经过人工改造后，Cas9蛋白可在与靶向序列互补的sgRNA的引导下，定位到基因组与PAM序列相邻的靶向序列进行剪切导致DSBs，通过NHEJ或HDR修复机制引入突变或新的基因，实现对真核细胞高效的、特异的基因编辑。CRISPR/Cas9基因编辑系统靶向位点选择灵活、效率高、载体构建方法简单，是近年来基因编辑领域的重大研究突破和研究热点。采用该系统进行特定基因的精准敲除、构建基因突变缺失细胞株，关键之处为sgRNA的设计。在sgRNA设计时，需注意位置、序列、特异性评分、有效性、脱靶等众多参数，才能提高sgRNA的打靶效率。当前国内尚未见研究报道与胃癌相关的ARID1A基因敲除的sgRNA设计，因此，通过设计ARID1A基因敲除的sgRNA，构建能在体外长期培养的ARID1A突变缺失的稳定人胃上皮细胞株，在探索胃癌发生新机制和新诊治靶点中具有重要的研究和应用价值。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种敲除ARID1A基因的sgRNA、构建ARID1A基因缺失细胞株的方法及应用。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术公开了用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA，所述sgRNA为Exon2-sgRNA或Exon3-sgRNA；其中，Exon2-sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，Exon3-sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术还公开了一种CRISPR/Cas9质粒，含有上述的用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA。本专利技术还公开了一种CRISPR/Cas9慢病毒系统，利用上述的用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA构建而成。本专利技术还公开了上述的CRISPR/Cas9慢病毒系统的构建方法，包括：1)使用BsmBI酶切CRISPR/Cas9慢病毒载体LentiCRISPRV2，得到酶切后线性化的CRISPR/Cas9慢病毒载体；2)利用上述的用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA序列，在其5'端添加CACC得到正向寡核苷酸链，在用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA序列的互补链的5'端添加AAAC得到反向寡核苷酸链；3)将步骤2)获得的正向寡核苷酸链、反向寡核苷酸链磷酸化和退火形成双链，然后与步骤1)获得的线性化的CRISPR/Cas9慢病毒载体连接，转化挑单克隆菌株，提取重组质粒，获得靶向敲除人ARID1A基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统。本专利技术还公开了一种慢病毒颗粒，利用上述的CRISPR/Cas9慢病毒系统用细胞包装获得。本专利技术还公开了一种试剂盒，包上述的用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA，和/或权利要求2所述的CRISPR/Cas9质粒，和/或权利要求3所述的CRISPR/Cas9慢病毒系统，和/或权利要求5所述的慢病毒颗粒。本专利技术还公开了上述的用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA、CRISPR/Cas9质粒、CRISPR/Cas9慢病毒系统和/或慢病毒颗粒在制备治疗胃癌的药物和/或制剂中的用途。本专利技术还公开了一种ARID1A基因缺失的细胞株，利用上述的CRISPR/Cas9慢病毒系统转染目的细胞株后获得。本专利技术还公开了上述的ARID1A基因缺失的细胞株的制备方法，包括：1)将所述CRISPR/Cas9慢病毒系统通过293T细胞进行包装，得到慢病毒颗粒；2)将慢病毒颗粒感染目的细胞株，有限稀释法传代筛选，获得ARID1A基因缺失的细胞株。进一步地，所述目的细胞株为人胃上皮永生化细胞株GES-1。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术提供敲除ARID1A基因的sgRNA能有效靶向ARID1A基因，将其构建入CRISPR/Cas9慢病毒系统，转染细胞可得到ARID1A基因缺失的细胞株。相对于其他基因编辑技术，此系统载体构建方法简单、基因编辑效率较高、可操作性强。(2)本专利技术提供的技术方案利用CRISPR/Cas9慢病毒系统对ARID1A基因编辑，在基因组水平上实现了特定基因的敲除，显著优于RNA干扰技术在mRNA或蛋白水平对基因的沉默不完全或者无法沉默等不足，构建出的长期稳定的基因缺失细胞株，为探索胃癌发生发展分子机制提供了关键的研究模型，同时未来还有望应用到其他癌症治疗中。附图说明图1为本专利技术实验整体流程图；图2为本专利技术构建的重组慢病毒质粒ARID1AsgRNA-1-lentiCRISPRv2的质粒图谱；图3为本专利技术构建的重组慢病毒质粒ARID1AsgRNA-1-lentiCRISPRv2的测序结果；图4为本专利技术提供的ARID1A基因敲除的GES-1细胞株ARID1A蛋白表达检测结果图；其中，WT代表野生型人胃上皮GES-1细胞株，Lv2代表感染慢病毒lentiCRISPRv2病毒液的GES-1细胞株，sgRNA-1-Lv2、sgRNA-2-Lv2分别代表感染重组慢病毒ARID1AsgRNA-1-lentiCRISPRv2、ARID1AsgRNA-2-lentiCRISPRv2病毒液的GES-1细胞株；图5为本专利技术构建的ARID1A基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA为Exon2-sgRNA或Exon3-sgRNA，Exon2-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，Exon3-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA为Exon2-sgRNA或Exon3-sgRNA，Exon2-sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，Exon3-sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。


2.一种CRISPR/Cas9质粒，其特征在于，含有权利要求1所述的用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA。


3.一种CRISPR/Cas9慢病毒系统，其特征在于，利用权利要求1所述的用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA构建而成。


4.权利要求3所述的CRISPR/Cas9慢病毒系统的构建方法，其特征在于，包括：
1)使用BsmBI酶切CRISPR/Cas9慢病毒载体LentiCRISPRV2，得到酶切后线性化的CRISPR/Cas9慢病毒载体；
2)利用权要求1所述的用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA序列，在其5'端添加CACC得到正向寡核苷酸链，在用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA序列的互补链的5'端添加AAAC得到反向寡核苷酸链；
3)将步骤2)获得的正向寡核苷酸链、反向寡核苷酸链磷酸化和退火形成双链，然后与步骤1)获得的线性化的CRISPR/Cas9慢病毒载体连接，转化挑单克隆菌株，提取重组质粒，获得靶向敲除人ARID1A基因的CRIS...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘希，廉洁，汪园园，邓元，李晓锋，张冠军，
申请(专利权)人：西安交通大学医学院第一附属医院，
类型：发明
国别省市：陕西;61