一种工程化核酸、T细胞及其应用和产生方法技术

本发明专利技术公开了一种工程化核酸，包括基因工程改造的抗原受体的核酸，能够特异性结合来自HPV的抗原；阻断肿瘤中表达的免疫检查点受体的核酸，该核酸可以编码一种阻断蛋白；一种工程化T细胞，包含上述的核酸序列；一种工程化T细胞在制备治疗癌症药物的应用；一种产生工程化T细胞的方法：将载体导入T细胞得到TCR‑T细胞，然后经扩增得到工程化的T细胞；所述载体包含所述的核酸。本发明专利技术一种工程化核酸、T细胞及其应用和产生方法，得到的T细胞可以识别HPV E6肿瘤抗原，同时能够分泌阻断程序性细胞死亡蛋白PD‑1的单链抗体；这些工程化T细胞表现出更强的抗肿瘤作用并能够减少T细胞衰竭；本发明专利技术还可用于表达HPV E6癌症的免疫治疗。

【技术实现步骤摘要】
一种工程化核酸、T细胞及其应用和产生方法本申请是中国专利申请201910573639.1的分案申请，原申请的申请日为2019年6月28日，其名称为“一种工程化核酸、T细胞及其应用和产生方法”。
本专利技术属于生物医药
，具体的说，涉及一种工程化核酸、T细胞及其应用和产生方法。
技术介绍
一些癌症(例如宫颈癌)主要由人乳头瘤病毒(HPV)感染引起。尽管化疗等治疗方法有一定效果，但许多癌症(包括HPV相关癌症)的预后可能较差。因此，存在对癌症，特别是HPV相关的癌症的医疗需求。HPV16是HPV的一种亚型，常引发恶性肿瘤。HPV16可以通过其中的E6蛋白起作用，它可以影响细胞周期从而引发癌症。HPV16的E6蛋白可以在多种癌症中表达，包括但不限于子宫颈癌，口咽癌，肛门癌，肛管癌，肛门直肠癌，阴道癌，外阴癌和阴茎癌。可以通过对TCR改造使T细胞特异性识别HPV16E6抗原。于其类似的是嵌合抗原受体(CAR)基因修饰T细胞(CAR-T)是一种有效的改造T细胞疗法，它的核心是使T细胞特异性靶向肿瘤相关抗原(TAA)，例如CD19和GD2，在用于治疗诸如B细胞恶性肿瘤和神经母细胞瘤的临床试验中有不错的效果。与天然存在的T细胞受体(TCR)不同，CAR是由与细胞内T细胞信号传导和共刺激结构域融合的人工受体。CAR可以以主要组织相容性类别(MHC)非依赖性方式直接识别TAA。尽管CAR-T细胞治疗在血液系统恶性肿瘤患者中取得了成功，但在大部分实体瘤中没有达到预期的效果。这可以归因于实体瘤中的免疫抑制微环境。这种环境涉及由T细胞中免疫检查点受体(IR)的表达。到目前为止已经发现了多种抑制T细胞功能的免疫检查点，例如CTLA-4、TIM-3、LAG-3以及PD-1。这些分子在慢性感染和癌症中可以促成T细胞功能的衰竭，从而导致肿瘤逃脱免疫监视。其中，PD-1在T细胞活化后会上调，进一步可以与其两个配体PD-L1或PD-L2相互作用从而抑制T细胞细胞因子的释放。PD-L1在T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突细胞上都有表达。同时它也在各种肿瘤细胞中大量表达。而PD-L1在正常组织中的表达很低。PD-1一直是近期研究的焦点，临床研究表明，PD-1阻断剂可用于治疗结肠癌、肾癌、肺癌、黑色素瘤等癌种。
技术实现思路
为解决以上技术问题，本专利技术的目的在于提供一种工程化核酸、T细胞及其应用和产生方法，得到的T细胞可以识别HPVE6肿瘤抗原，同时能够分泌阻断程序性细胞死亡蛋白PD-1的单链抗体；这些工程化T细胞表现出更强的抗肿瘤作用并能够减少T细胞衰竭；本专利技术还可用于表达HPVE6癌症的免疫治疗。本专利技术目的是这样实现的：一、一种工程化核酸，其关键在于包括：(a)基因工程改造的抗原受体的核酸，能够特异性结合来自HPV的抗原；所述核酸序列为SEQIDNO.1:GGACAGCAGCTGAACCAGAGCCCCCAGAGCATGTTCATCCAGGAGGGCGAGGACGTGTCCATGAATTGCACCAGCAGCAGCATCTTCAACACTTGGCTGTGGTACAAGCAGGACCCAGGAGAGGGACCAGTGCTGCTGATTGCCCTGTACAAGGCCGGAGAGCTGACCTCTAACGGCAGACTGACCGCTCAGTTCGGCATCACCAGGAAGGACAGCTTCCTCAACATCAGCGCCAGCATCCCCAGCGACGTCGGAATCTACTTTTGCGCCGGCCACCCTAGCAGCAATAGCGGCTACGCCCTGAACTTCGGCAAGGGCACAAGCCTGCTGGTGACACCA；该核酸可以编码一种特异性识别HPV抗原的工程化受体TCR；(b)阻断肿瘤中表达的免疫检查点受体的核酸，该核酸包括以下序列模块：重链CDR1(SEQIDNO.2)：GGATACACCTTTACCAACTATTAC；重链CDR2(SEQIDNO.3)：ATTAACCCAAGTAATGGTGGTACA；重链CDR3(SEQIDNO.4)：ACACGGCGAGATTACAATTACGATGGAGGGTTCGACTAC；轻链CDR1(SEQIDNO.5)：AAATCAGTCTCAACTTCTGGTTTTAAT；轻链CDR2(SEQIDNO.6)：CTGGCGTCA；轻链CDR3(SEQIDNO.7)：CAACATGGACGGGAGCTGCCCTTGACG；该核酸可以编码一种阻断蛋白。优选地，上述HPV的抗原为E6或E7抗原。优选地，上述免疫检查点受体为PD-1受体。二、一种工程化T细胞，其关键在于：包含所述的核酸，所述核酸能够编码基因工程改造的抗原受体和编码阻断抑制型受体的蛋白，所述受体能够特异性结合HPV的抗原，所述蛋白具有阻断肿瘤中免疫检查点受体的功能或表达。工程化的T细胞可以特异性靶向HPV的E6抗原，同时分泌阻断程序性细胞死亡蛋白的抗体，因此这些改造的T细胞能够表现出更强的抗肿瘤反应和降低T细胞衰竭的能力。优选地，上述抗原受体氨基酸序列为SEQIDNO.8：GlyGlnGlnLeuAsnGlnSerProGlnSerMetPheIleGlnGluGlyGluAspValSerMetAsnCysThrTyrLysAlaGlyGluLeuThrSerAsnGlyArgLeuThrAlaGlnPheGlyIleThrArgLysAspSerPheLeuAsnIleSerAlaSerIleProSerAspValGlyIleTyrPheCysAlaGlyHisProSerSerAsnSerGlyTyrAlaLeuAsnPheGlyLysGlyThrSerLeuLeuValThrPro。优选地，上述阻断抑制型受体的蛋白是一种持续表达的抗PD-1的单链抗体。scFv保留了衍生它的完整抗体的特异性，所述抗PD-1的单链抗体包含以下氨基酸序列模块：重链CDR1SEQIDNO.9：GlyTyrThrPheThrAsnTyrTyr；重链CDR2SEQIDNO.10：AsnProSerAsnGlyGlyThr；重链CDR3SEQIDNO.11：ThrArgArgAspTyrAsnTyrAspGlyGlyPheAspTyr；轻链CDR1SEQIDNO.12：LysSerValSerThrSerGlyPheAsn；轻链CDR2SEQIDNO.13：LeuAlaSer；轻链CDR3SEQIDNO.14：GlnHisGlyArgGluLueProLeuThr；所述的轻链和重链可以是任何顺序，例如，VH-接头-VL或VL-接头-VH，只要保留scFv的靶抗原特异性即可。三、一种工程化T细胞在制备治疗癌症药物的应用。优选地，上述癌症为宫颈癌或头颈癌。四、一种产生工程化T细胞的方法，其关键在于按以下步骤进行：将载体导入T细胞得到TCR-T细胞，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗PD-1的抗体，所述抗PD-1抗体包含以下氨基酸序列：/n重链CDR1 SEQ ID NO.9；/n重链CDR2 SEQ ID NO.10；/n重链CDR3 SEQ ID NO.11；/n轻链CDR1 SEQ ID NO.12；/n轻链CDR2 SEQ ID NO.13；/n轻链CDR3 SEQ ID NO.14。/n

【技术特征摘要】
20180811 US 62/717,7871.一种抗PD-1的抗体，所述抗PD-1抗体包含以下氨基酸序列：
重链CDR1SEQIDNO.9；
重链CDR2SEQIDNO.10；
重链CDR3SEQIDNO.11；
轻链CDR1SEQIDNO.12；
轻链CDR2SEQIDNO.13；
轻链CDR3SEQIDNO.14。


2.根据权利要求1所述的抗PD-1的抗体，所述抗体为单链抗体。


3.根据权利要求1或2所述的抗PD-1的抗体，所述抗体为scFv。


4.根据权利要求3所述的抗PD-1的抗体，其特征在于，所述scFv含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，且VH和VL通过接头连通。


5.根据权利要求4所述的抗PD-1的抗体，其特征在于，所述scFv中VH和VL的连接顺序为：VH-接头-VL。


6.根据权利要求4所述的抗PD-1的抗体，其特征在于，所述scFv中VH和VL的连接顺序为：VL-接头-VH。


7.根据权利要求4-6任一项所述的抗PD-1的抗体，接头为GS连接肽。


8.一种阻断肿瘤中免疫检查点功能的核酸，所述核酸包括以下序列：重链CDR1：SEQIDNO.2；重链CDR2：SEQIDNO.3；重链CDR3：SEQIDNO.4；轻链CDR1：SEQIDNO.5；轻链CDR2：SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：王品，李思，
申请(专利权)人：广东天科雅生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44