新型抗CD19抗体和CD19-CAR-T细胞的制备及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种新型抗CD19抗体和CD19‑CAR‑T细胞的制备及其应用。具体地，本发明专利技术提供了一种CD19抗体，所述抗体靶向第一外显子缺失的CD19分子，可以用于复发性，耐药性肿瘤的治疗和检测。本发明专利技术还提供了包含该新型CD19特异性的CAR‑T细胞，及其制备方法和应用。

【技术实现步骤摘要】
新型抗CD19抗体和CD19-CAR-T细胞的制备及其应用
本专利技术涉及药物领域，更具体地涉及新型抗CD19抗体和CD19-CAR-T细胞的制备及其应用。
技术介绍
B细胞包括前B细胞、早期发育的B细胞和成熟B细胞等。成熟B细胞通过末端分化成为浆细胞和恶性B细胞。大多数的前B急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、非霍奇金氏恶性淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、前淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、普通急性淋巴细胞白血病和一些非急性淋巴母细胞性白血病都高表达CD19。在浆细胞上的CD19的表达进一步说明其可在不同的B细胞瘤例如多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、华氏瘤上表达。因此CD19被认为是多种血液肿瘤的靶标。在现有的CD19抗体和CD19-CAR-T细胞治疗白血病或淋巴瘤中，常常由于CD19抗原片段丢失使得靶抗原完全或部分缺失，导致病人治疗后白血病复发。此外，现有的CD19-CAR-T细胞治疗中，在CAR结构被错误导入肿瘤细胞的情况下，可以导致肿瘤细胞上表达抗CD19的CAR，通过CAR结构成分中的scFV结合肿瘤自身的CD19分子，进而屏蔽肿瘤的CD19分子，使得肿瘤细胞不再能够被CD19-CAR-T细胞上同一结构的scFV所识别，导致肿瘤细胞不能被杀灭最终治疗失败。因此，本领域迫切需要开发可以识别CD19不同表位，避免脱靶的新型抗CD19抗体以及包含该抗体的CD19-CAR-T细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供针对复发性肿瘤的CD19抗体和CD19-CAR-T细胞及其制备和应用。在本专利技术的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQIDNO.:1所示的CDR1，SEQIDNO.:2所示的CDR2，和SEQIDNO.:3所示的CDR3；或者，SEQIDNO.:9所示的CDR1，SEQIDNO.:10所示的CDR2，和SEQIDNO.:11所示的CDR3；其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD19结合亲和力的衍生序列。在另一优选例中，所述重链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQIDNO.:7所示的氨基酸序列。在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQIDNO.:15所示的氨基酸序列。在本专利技术的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有本专利技术第一方面所述的重链可变区。在另一优选例中，所述的抗体的重链还包括重链恒定区。在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的。在本专利技术的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：或者，SEQIDNO.:4所示的CDR1’，SEQIDNO.:5所示的CDR2’，和SEQIDNO.:6所示的CDR3’；或者，SEQIDNO.:12所示的CDR1’，SEQIDNO.:13所示的CDR2’，和SEQIDNO.:14所示的CDR3’；其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD19结合亲和力的衍生序列。在另一优选例中，所述轻链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQIDNO.:8所示的氨基酸序列。在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQIDNO.:16所示的氨基酸序列。在本专利技术的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有本专利技术第三方面所述的轻链可变区。在另一优选例中，所述的抗体的轻链还包括轻链恒定区。在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源的。在本专利技术的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：(1)本专利技术第一方面所述的重链可变区；和/或(2)本专利技术第三方面所述的轻链可变区；或者，所述抗体具有：本专利技术第二方面所述的重链；和/或本专利技术第四方面所述的轻链。在另一优选例中，所述抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。在另一优选例中，所述人源化抗体的CDR区包含1、2、或3个氨基酸的变化。在另一优选例中，所述的动物为非人哺乳动物，较佳地为鼠、羊、兔。在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化的单克隆抗体。在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，较佳地为20％，更佳地为10％。在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-7个，较佳地为1-3个，更佳地为1个。在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代的至少一个氨基酸序列为同源性为至少80％的氨基酸序列。在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的衍生序列具有抑制细胞表面CD19或重组CD19蛋白的功能。在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物形式。在另一优选例中，所述衍生序列对CD19的亲和力KD为0.01nM-1nM，较佳地为0.02nM-0.1nM。在另一优选例中，如本专利技术第一方面所述的重链可变区、如本专利技术第二方面所述的重链、如本专利技术第三方面所述的轻链可变区、如本专利技术第四方面所述的轻链、或本专利技术第五方面所述的抗体靶向第一外显子缺失的CD19分子(不与CD19的第一外显子对应的表位结合)。本专利技术的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：(i)如本专利技术第一方面所述的重链可变区、如本专利技术第二方面所述的重链、如本专利技术第三方面所述的轻链可变区、如本专利技术第四方面所述的轻链、或本专利技术第五方面所述的抗体；以及(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。本专利技术的第七方面，提供了一种CAR构建物，所述的CAR构建物的单克隆抗体抗原结合区域的scFV段为特异性结合于CD19的结合区，并且所述scFv具有如本专利技术第一方面所述的重链可变区和如本专利技术第三方面所述的轻链可变区。本专利技术的第八方面，提供了一种重组的免疫细胞，所述的免疫细胞表达外源的如本专利技术第七方面所述的CAR构建物。在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。在另一优选例中，所述免疫细胞是离体的。在另一优选例中，所述免疫细胞为自体的。在另一优选例中，所述免疫细胞为非自体的。在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：/nSEQ ID NO.:1所示的CDR1，/nSEQ ID NO.:2所示的CDR2，和/nSEQ ID NO.:3所示的CDR3；/n或者，/nSEQ ID NO.:9所示的CDR1，/nSEQ ID NO.:10所示的CDR2，和/nSEQ ID NO.:11所示的CDR3；/n其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留AXL结合亲和力的衍生序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQIDNO.:1所示的CDR1，
SEQIDNO.:2所示的CDR2，和
SEQIDNO.:3所示的CDR3；
或者，
SEQIDNO.:9所示的CDR1，
SEQIDNO.:10所示的CDR2，和
SEQIDNO.:11所示的CDR3；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留AXL结合亲和力的衍生序列。


2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有权利要求1所述的重链可变区。


3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQIDNO.:4所示的CDR1’，
SEQIDNO.:5所示的CDR2’，和
SEQIDNO.:6所示的CDR3’；
或者，
SEQIDNO.:12所示的CDR1’，
SEQIDNO.:13所示的CDR2’，和
SEQIDNO.:14所示的CDR3’；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留AXL结合亲和力的衍生序列。


4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有如权利要求3所述的轻链可变区。


5.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：
(1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或
(2)如权利要求3所述的轻链可变区；
或者，所述抗体具有：如权利要求2所述的重链；和/或如权利要求4所述的轻链。


6.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄纲雄，
申请(专利权)人：福州拓新天成生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35