枯草杆菌酶变体和包含其的组合物制造技术

提供了具有改善的稳定性的枯草杆菌酶变体、包含这些变体的洗涤剂组合物、这些变体和洗涤剂组合物在清洁过程例如衣物洗涤或硬表面清洁如餐具洗涤中的用途、以及产生这些变体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】枯草杆菌酶变体和包含其的组合物序列表的引用本申请含有计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。
本专利技术涉及枯草杆菌酶变体，包含该变体的组合物，编码该变体的多核苷酸，产生该变体的方法，和使用该变体和组合物的方法。
技术介绍
枯草杆菌蛋白酶是来自S8家族、特别是来自S8A亚家族的丝氨酸蛋白酶，如MEROPS数据库(https://www.ebi.ac.uk/merops/index.shtml)所定义的。在亚家族S8A家族中，关键活性位点残基Asp、His和Ser典型地是在以下基序中发现：这些基序不同于S8B亚家族的那些基序。在洗涤剂工业中，酶已经在洗涤配制品中实施了几十年。用于此类配制品中的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露糖苷酶以及其他酶或其混合物。商业上，最重要的酶是蛋白酶。越来越多的商业上使用的蛋白酶(用于例如衣物和餐具洗涤洗涤剂)是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白质工程化的变体。另外，其他枯草杆菌酶变体在本领域中已有描述，相对于亲本枯草杆菌酶具有改变，导致有所改善，例如更好的洗涤性能、热稳定性、储存稳定性或催化活性。然而，多种因素使得蛋白酶的进一步改善是有利的。例如，洗涤条件(例如温度和pH)倾向于随时间变化，并且在世界上不同的国家或地区也不同，并且在常规洗涤条件下仍然难以完全去除许多污渍。洗涤剂组合物中的另一个挑战是酶稳定性，因为这些组合物的化学组分以及pH，温度和湿度的条件通常倾向于使酶失活。此外，洗涤中条件还可以导致酶失活(归因于例如pH、温度或螯合不稳定性)，从而导致在洗涤循环过程中洗涤性能的损失。因此，尽管在蛋白酶开发上进行了密集研究，对相比于亲本枯草杆菌酶具有改善的稳定性(例如改善的储存稳定性，例如在洗涤剂组合物中)，并且其同时具有相似的或改善的洗涤性能的新的且改善的蛋白酶仍存在需求。本专利技术通过提供在稳定性和洗涤性能方面具有有利特性的新颖枯草杆菌酶变体来解决这些挑战。
技术实现思路
本专利技术涉及适合用于在例如洗涤剂组合物中使用的新颖枯草杆菌酶变体，其中这些变体在相对于SEQIDNO:1的至少9、19和62位置处包含取代，特别是取代S9R+R19L+N62D，例如取代S3T+S9R+R19L+N62D+A194P。本专利技术还涉及包含变体的组合物，特别是洗涤剂组合物，编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生这些变体的方法。序列综述SEQIDNO:1是蛋白酶枯草杆菌蛋白酶309(也称为)的氨基酸序列。SEQIDNO:2是枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。附图说明图1是枯草杆菌蛋白酶309(SEQIDNO:1)和枯草杆菌蛋白酶BPN’(SEQIDNO:2)的氨基酸序列的比对。定义枯草杆菌酶/蛋白酶：术语“枯草杆菌酶”和“蛋白酶”可以在本文中可互换地使用，并且是指水解蛋白质中的肽键的酶。这包括属于EC3.4酶组(包括其13个亚类中的每一个)的任何酶，并且特别是内肽酶(EC3.4.21)。EC编号参考来自NC-IUBMB的EnzymeNomenclature1992[1992年酶命名法],学术出版社(AcademicPress),圣地亚哥,加利福尼亚州，分别包括在Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊],1994,223,1-5；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊],1995,232,1-6；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊],1996,237,1-5；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊],1997,250,1-6；以及Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊],1999,264,610-650中出版的增刊1-5。蛋白酶活性：术语“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性(EC3.4)，特别是内肽酶活性(EC3.4.21)。存在若干种蛋白酶活性类型，三种主要活性类型是：胰蛋白酶样，其中在P1处的Arg或Lys之后存在酰胺底物的裂解，胰凝乳蛋白酶样，其中在P1处的一个疏水性氨基酸之后发生裂解，和弹性蛋白酶样，其中在P1处的Ala之后发生裂解。蛋白酶活性可根据WO2016/087619中描述的程序确定。本专利技术的这些枯草杆菌蛋白酶变体优选地具有SEQIDNO:1的多肽的至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的蛋白酶活性。等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。编码序列：术语“编码序列”意指直接指定变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本专利技术的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，该分子包含编码变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。片段：术语“片段”意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽；其中片段具有枯草杆菌酶活性。这样的片段优选地含有SEQIDNO:1中的氨基酸数目的至少85％、至少90％或至少95％。宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本专利技术的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。改善的特性：术语“改善的特性”意指与变体相关的特征，该变体与亲本蛋白酶(具有SEQIDNO:1的蛋白酶)或选择的参比蛋白酶(例如SEQIDNO:1的变体)相比有所改善。此类改善的特性可以包括但不限于：催化效率、催化速率、化学稳定性、氧化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种枯草杆菌酶变体，该变体包含取代X9R+X19L+X62D，其中/n(a)位置编号对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置；/n(b)该变体具有蛋白酶活性；并且/n(c)该变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少80％但小于100％的序列同一性；/n并且其条件是该变体并不包含位置14中的组氨酸残基。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20190128 CN PCT/CN2019/0733981.一种枯草杆菌酶变体，该变体包含取代X9R+X19L+X62D，其中
(a)位置编号对应于SEQIDNO:2的多肽的位置；
(b)该变体具有蛋白酶活性；并且
(c)该变体与SEQIDNO:1的多肽具有至少80％但小于100％的序列同一性；
并且其条件是该变体并不包含位置14中的组氨酸残基。


2.如权利要求1所述的枯草杆菌酶变体，该变体包含取代S9R+R19L+N62D，并且该变体进一步包含选自由以下组成的组的至少一个改变：S3T、S3A、N43R、V68A、N76D、P131*、A194P、V205I、Q245R、S259D、N261D和R275Q，其中位置编号对应于SEQIDNO:2的多肽的位置。


3.如权利要求2所述的枯草杆菌酶变体，其中该变体包含选自由以下组成的组的一组改变：
·S3T+S9R+R19L+N62D+A194P；
·S3T+S9R+R19L+N62D+A194P+Q245R+S259D；
·S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+A194P+R275Q；
·S3T+S9R+R19L+N62D+P131*+A194P；
·S3T+S9R+R19L+N62D+P131*+A194P+Q245R+S259D；
·S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+P131*+A194P+R275Q；
·S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+A194P；
·S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+P131*+A194P；
·S3T+S9R+R19L+N62D+Q245R+S259D；
·S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+R275Q；
·S3T+S9R+R19L+N62D+P131*；
·S3T+S9R+R19L+N62D+P131*+Q245R+S259D；
·S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+P131*+R275Q；
·S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D；
·S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+Q245R+S259D；
·S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+P131*；
·S9R+A15T+G61E+N62D+V68A+A194P+V205I+Q245R+N261D；
·S9R+A15T+G61E+V68A+A194P+V205I+Q245R+S259D+N261D；
·S9R+R19L+N43R+N62D+R275Q；
·S9R+R19L+N62D+P131*；
·S3A+S9R+R19L+N62D+Q245R+S259D；
·S3A+S9R+R19L+N62D+A194P；
·S9R+R19L+N43R+N62D+Q245R+S259D+R275Q；
·S9R+R19L+N62D+P131*+Q245R+S259D；
·S9R+R19L+N43R+N62D+A194P+R275Q；
·S9R+R19L+N62D+P131*+A194P；
·S9R+R19L+N43R+N62D+N76D；
·S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+Q245R+S259D+R275Q；
·S3A+S9R+R19L+N62D+P131*+Q245R+S259D；
·S3A+S9R+R19L+N62D+A194P+Q245R+S259D；
·S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+P131*+R275Q；
·S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+A194P+R275Q；
·S3A+S9R+R19L+N62D+P131*+A194P；
·S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D；
...

【专利技术属性】
技术研发人员：高楠，RT伦哈德，CM鲍尔，EP弗里斯，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK