遗传修饰细胞的减少和最少的操作制造制造技术

描述了用于遗传修饰已进行了减少或最少的操作的生物样品中所选细胞类型的纳米颗粒。所述纳米颗粒递送精确基因组工程所需的所有组分并克服与当前临床实践相关的许多缺点以出于治疗目的遗传工程化细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】遗传修饰细胞的减少和最少的操作制造相关申请的交叉引用本申请要求2018年12月5日提交的美国临时专利申请号62/775,721的优先权，所述临时专利申请以引用的方式整体并入本文，就如同在本文中全面陈述一样。关于序列表的声明与本申请相关的序列表以文本文件格式代替纸质副本提供，并且特此以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是F053-0091PCT_ST25.txt。文本文件是296KB，在2019年12月5日创建，并且经由EFS-Web电子提交。
本公开提供了以减少的或最少的操作遗传修饰所选的细胞类型的纳米颗粒。纳米颗粒递送精确基因组工程所需的所有组分并克服与当前临床实践相关的许多缺点以出于治疗目的遗传工程化细胞。
技术介绍
患者特异性基因疗法具有治疗遗传性、感染性和恶性疾病的巨大潜力。例如，逆转录病毒介导的基因添加到造血干细胞(HSC)以及造血干细胞和祖细胞(HSPC)中在过去10年中已经证明了对几种遗传疾病的治疗结果，所述疾病包括遗传性免疫缺陷(例如，X连锁和腺苷脱氨酶缺乏的重症联合免疫缺陷(SCID))、血红蛋白病、Wiskott-Aldrich综合征和异染性脑白质营养不良。此外，这种治疗方法还改善了不良预后诊断诸如成胶质细胞瘤的结果。与来自供体的细胞相反，使用基因校正的自体或“自身”细胞消除了移植物-宿主免疫应答的风险，从而不需要免疫抑制药物。目前临床医学中使用的系统缺乏将基因编辑组分递送至HSC和HSPC以及其他血细胞类型的最佳方法。例如，CRISPR-Cas9平台是临床环境中用于HSPC中的基因编辑的一种方法。如果目的是基因破坏，则仅需要电穿孔来递送基因编辑组分。然而，电穿孔对许多细胞类型有毒性，并且在起始细胞数低的情况下，这种毒性对于使用HSC和/或HSPC的疗法尤其成问题。如果目的是插入新的遗传物质，则必须包括用于同源定向修复的DNA模板。如果新的遗传物质较小，这可以通过在单链DNA(ssDNA)模板中进行电穿孔来实现，但是对于较大的模板，使用腺相关病毒载体(AAV)是目前临床实践中的黄金标准。无论单独使用电穿孔还是与AAV组合使用电穿孔，都不能保证将要递送的所有单独的基因编辑组分都递送到相同的细胞中。此外，电穿孔依赖于细胞膜的机械破坏和透化，因此损害了细胞的活力，使得它们对于治疗性用途来说不太理想。此外，与基于病毒的方法一样，电穿孔不能选择性地将基因从异质池中递送到特定细胞类型，因此必须在其之前进行细胞选择和纯化过程。细胞选择和纯化过程是导致不期望的高毒性水平的苛刻过程。最后，当细胞再灌注时，AAV处理具有免疫原性潜力。可简化所需步骤并确保将所有组分递送至预期细胞类型的递送基因编辑组分的任何改进方法都将是临床医学领域的显著改进。已经提出了诸如聚合复合物和脂质体复合物的纳米颗粒，但是这些已经表明是有毒性的，证明了有限的基因编辑组分递送效率以及在HSC和HSPC中有限的基因编辑功效。
技术实现思路
本公开提供了允许以减少的和最少的操作对所选细胞类型进行选择性遗传修饰的纳米颗粒(NP)。减少的操作意味着不需要使用电穿孔和病毒载体，诸如AAV。最少的操作意味着不需要使用电穿孔、病毒载体以及细胞选择和纯化过程。此外，本公开还提供了特异性工程化以递送基因组编辑所需的所有组分的NP。NP可用于需要功能丧失突变的疗法，但重要的是，也可提供基因添加或特定突变的校正所需的所有组分。所描述的方法是安全的(即，没有脱靶毒性)、可靠的、可扩展的、易于制造的、合成的和即插即用的(即，相同的基础平台可用于递送不同的治疗性核酸)。附图说明本文提交的许多附图利用彩色更好地理解。申请人将附图的彩色版本视为原始提交的一部分，并保留在以后的程序中呈递附图的彩色图像的权利。图1A-1C.(图1A)目前临床上使用的用于离体基因编辑的系统缺乏用于HSC、HSPC和其他血细胞的最佳递送方法。如(图1A)所示，目前临床上使用的方案包括8个步骤：(1)动员和单采；(2)靶细胞类型的免疫磁性分离(例如，图1A中的CD34+HSPC)；(3)用重组生长因子(rhGF)刺激培养基中的分离细胞；(4)电穿孔细胞以递送基因编辑组分(例如，图1A中的CRISPR/Cas9核糖核蛋白)；(5)电穿孔后孵育培养基和rhGF中的细胞；(6)用携带基因编辑供体模板的病毒载体(例如，图1A中的腺相关病毒载体(AAV))转导；(7)进一步孵育培养基和rhGF中的细胞；和(8)用于再输注到受调节的患者中的细胞收获。临床医学的目的是减少和最少的操作制造。(图1B)减少的操作制造不需要电穿孔或病毒载体递送，但仍可利用靶细胞纯化过程。如(图1B)所示，本文公开的NP可用于减少对(图1A)的步骤3-6的依赖。(图1C)在一些实施方案中，最少操作离体制造不需要分离所选的细胞类型、电穿孔或病毒介导的基因编辑组分递送，因此极大地提高了离体细胞制造的效率。本文公开的具有靶向配体的NP进一步减少对图1A的步骤2-7的依赖，并且不需要使用细胞选择和纯化过程。图2(现有技术).CD34+CD45RA-CD90+细胞负责血液再繁殖。通过流式分选将非人灵长类CD34+细胞分离成部分i(CD45RA-CD90+)、ii(CD45RA-CD90-)和iii(CD45RA+CD90-)，然后用编码绿色荧光蛋白、mCherry或mCerulean的LV转导并移植到骨髓消融的自体受体中。在所有情况下，血细胞植入仅对应于CD34+CD45RA-CD90+(部分i)细胞。图3(现有技术).移植的CD34高CD45RA-CD90+细胞/kg体重与嗜中性粒细胞和血小板植入的对数相关性(Spearman等级相关系数R2：0.0-0.19＝非常弱，0.20-0.39＝弱，0.4-0.59＝中等，0.6-0.79＝强，0.8-1.0＝非常强)。线性回归和95％置信区间分别用实线和虚线表示。图4.当施用给人时，AuNP尺寸决定目标组织/消除途径。图5A-5D.示意图表示NP的合成和结构。(图5A)金纳米颗粒(AuNP)的早期生产方案的示意图，金纳米颗粒是具有已确立的体内相容性的可扩展的合成递送支架。(图5B)用于产生和负载具有示例性基因编辑组分的AuNP的合成方法的示意图。一个描绘的AuNP示出连接到AuNP表面的crRNA。然后将Cpf1核酸酶和ssDNA连接到crRNA上。另一个描绘的AuNP示出连接到18-乙二醇间隔物的crRNA，其具有连接到19nmAuNP核心的表面的硫醇修饰。CRISPR核酸酶连接到cRNA以形成RNP。AuNP涂覆有低分子量(MW(例如，2000))聚乙烯亚胺(PEI)。将ssDNA层压在PEI涂覆的表面上。(图5C)Au/CRISPRNP组装过程的示意图。1)合成并纯化AuNP核心。2)具有间隔臂和硫醇基团的crRNA缀合到金(Au)核心的表面。3)通过CRISPR核酸酶与crRNA的相互作用在表面上形成RNP复合物。4)用2KMW的PEI涂覆RNP复合物。5)通过与PEI的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种遗传修饰生物样品中的造血干细胞和祖细胞(HSPC)群体的方法，其包括向所述生物样品添加金纳米颗粒(AuNP)，其中所述AuNP包含/n直径小于20nm的金(Au)核心；/n成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)指导RNA(crRNA)-核酸酶核糖核蛋白(RNP)复合物，其中所述crRNA包含3’末端和5’末端，其中所述3’末端缀合到具有硫醇修饰的间隔物，并且所述5’末端缀合到所述核酸酶，并且其中所述硫醇修饰共价连接到所述Au核心的表面，并且其中所述crRNA具有如SEQ ID NO：262；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：14；或SEQ IDNO：241-261中所示的序列；/n带正电荷的聚乙烯亚胺聚合物涂层，其中所述带正电荷的聚乙烯亚胺聚合物具有小于2500道尔顿的分子量，包围所述RNP复合物，并且接触所述Au核心的表面；以及/n供体模板，其在所述带正电荷的聚合物涂层的表面上包含同源定向修复模板(HDT)，其中所述HDT模板包含如SEQ ID NO：48；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：33-41；SEQID NO：44-47；或SEQ ID NO：49-51中所示的序列；以及/n包含抗体克隆REA820、REA753、REA816、293C3、AC141、AC133或7的结合结构域的CD133靶向配体/n其中所述靶向配体通过胺-巯基交联剂或巯基-巯基交联剂与所述核酸酶连接并且/n其中所述HSPC群体未暴露于电穿孔、编码HDT的病毒载体或磁性细胞分离过程，并且其中所述方法导致不多于30％的HSPC细胞毒性并且在所述HSPC群体内提供至少10％的基因编辑效率。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181205 US 62/775,7211.一种遗传修饰生物样品中的造血干细胞和祖细胞(HSPC)群体的方法，其包括向所述生物样品添加金纳米颗粒(AuNP)，其中所述AuNP包含
直径小于20nm的金(Au)核心；
成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)指导RNA(crRNA)-核酸酶核糖核蛋白(RNP)复合物，其中所述crRNA包含3’末端和5’末端，其中所述3’末端缀合到具有硫醇修饰的间隔物，并且所述5’末端缀合到所述核酸酶，并且其中所述硫醇修饰共价连接到所述Au核心的表面，并且其中所述crRNA具有如SEQIDNO：262；SEQIDNO：13；SEQIDNO：14；或SEQIDNO：241-261中所示的序列；
带正电荷的聚乙烯亚胺聚合物涂层，其中所述带正电荷的聚乙烯亚胺聚合物具有小于2500道尔顿的分子量，包围所述RNP复合物，并且接触所述Au核心的表面；以及
供体模板，其在所述带正电荷的聚合物涂层的表面上包含同源定向修复模板(HDT)，其中所述HDT模板包含如SEQIDNO：48；SEQIDNO：4；SEQIDNO：15；SEQIDNO：33-41；SEQIDNO：44-47；或SEQIDNO：49-51中所示的序列；以及
包含抗体克隆REA820、REA753、REA816、293C3、AC141、AC133或7的结合结构域的CD133靶向配体
其中所述靶向配体通过胺-巯基交联剂或巯基-巯基交联剂与所述核酸酶连接并且
其中所述HSPC群体未暴露于电穿孔、编码HDT的病毒载体或磁性细胞分离过程，并且其中所述方法导致不多于30％的HSPC细胞毒性并且在所述HSPC群体内提供至少10％的基因编辑效率。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述crRNA靶向如SEQIDNO：25；SEQIDNO：3；SEQIDNO：24；SEQIDNO：26-32；SEQIDNO：42；SEQIDNO：43；或SEQIDNO：214-224中所示的序列。


3.如权利要求1所述的方法，其中所述crRNA具有如SEQIDNO：262、SEQIDNO：261或SEQIDNO：259中所示的序列。


4.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸酶包括Cpf1或Cas9。


5.如权利要求1所述的方法，其中所述带正电荷的聚合物涂层包含
分子量为2000道尔顿的聚乙烯亚胺。


6.如权利要求1所述的方法，其中Au核心与核酸酶的重量/重量(w/w)比为0.6。


7.如权利要求1所述的方法，其中Au核心与HDT的w/w比为1.0。


8.一种遗传修饰生物样品中所选细胞群体的方法，其包括向所述生物样品添加金纳米颗粒(AuNP)，其中所述AuNP包含
直径小于30nm的金(Au)核心；
指导RNA(gRNA)-核酸酶核糖核蛋白(RNP)复合物，其中所述gRNA包含3’末端和5’末端，其中所述3’末端缀合到具有化学修饰的间隔物，并且所述5’末端缀合到所述核酸酶，并且其中所述化学修饰共价连接到所述Au核心的表面；
带正电荷的聚合物涂层，其中所述带正电荷的聚合物具有小于2500道尔顿的分子量，包围所述RNP复合物，并且接触所述Au核心的表面；以及
供体模板，其在所述带正电荷的聚合物涂层的表面上包含同源定向修复模板(HDT)
其中所述所选细胞群体未暴露于电穿孔或编码的病毒载体，并且其中所述方法导致不多于30％的所述所选细胞群体的细胞毒性并且在所述所选细胞群体内提供至少10％的基因编辑效率。


9.如权利要求8所述的方法，其中Au核心与核酸酶的重量/重量(w/w)比为0.6。


10.如权利要求8所述的方法，其中Au核心与HDT的w/w比为1.0。


11.如权利要求8所述的方法，其中所述AuNP的直径小于70nm。


12.如权利要求8所述的方法，其中所述AuNP具有小于0.2的多分散指数(PDI)。


13.如权利要求8所述的方法，其中所述gRNA包含成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)crRNA。


14.如权利要求13所述的方法，其中所述crRNA靶向如SEQIDNO：1；SEQIDNO：3；SEQIDNO：20-32；SEQIDNO：42；SEQIDNO：43；SEQIDNO：84-97；或SEQIDNO：214-224中所示的序列。


15.如权利要求13所述的方法，其中所述crRNA包含如SEQIDNO：5；SEQIDNO：6；SEQIDNO：13；SEQIDNO：14；或SEQIDNO：225-264中所示的序列。


16.如权利要求8所述的方法，其中所述核酸酶包括Cpf1或Cas9。


17.如权利要求8所述的方法，其中所述带正电荷的聚合物涂层包含聚乙烯亚胺(PEI)、聚酰胺基胺(PAMAM)；聚赖氨酸(PLL)、聚精氨酸；纤维素、葡聚糖、精胺、亚精胺或聚(乙烯基苄基三烷基铵)。


18.如权利要求8所述的方法，其中所述带正电荷的聚合物具有1500-2500道尔顿的分子量。


19.如权利要求8所述的方法，其中所述带正电荷的聚合物具有2000道尔顿的分子量。


20.如权利要求8所述的方法，其中所述化学修饰包括游离硫醇、胺或羧酸酯官能团。


21.如权利要求8所述的方法，其中所述间隔物包含寡聚乙二醇间隔物。


22.如权利要求21所述的方法，其中所述寡聚乙二醇间隔物包含18原子寡聚乙二醇间隔物。


23.如权利要求8所述的方法，其中所述HDT包含与经历修饰的基因组序列具有同源性的序列。


24.如权利要求23所述的方法，其中所述HDT包含如SEQIDNO：2；SEQIDNO：4；SEQIDNO：8；SEQIDNO：15；SEQIDNO：33-41；或SEQIDNO：44-52中所示的序列。


25.如权利要求8所述的方法，其中所述HDT包含单链DNA(ssDNA)。


26.如权利要求8所述的方法，其中所述供体模板包含治疗性基因。


27.如权利要求26所述的方法，其中所述治疗性基因包含或编码骨骼蛋白4.1、血型糖蛋白、p55、Duffy等位基因、珠蛋白家族基因；WAS；phox；抗肌萎缩蛋白；丙酮酸激酶；CLN3；ABCD1；芳基硫酸酯酶A；SFTPB；SFTPC；NLX2.1；ABCA3；GATA1；核糖体蛋白基因；TERT；TERC；DKC1；TINF2；CFTR；LRRK2；PARK2；PARK7；PINK1；SNCA；PSEN1；PSEN2；APP；SOD1；TDP43；FUS；泛素2；C9ORF72、α2β1；αvβ3；αvβ5；αvβ63；BOB/GPR15；Bonzo/STRL-33/TYMSTR；CCR2；CCR3；CCR5；CCR8；CD4；CD46；CD55；CXCR4；氨基肽酶-N；HHV-7；ICAM；ICAM-1；PRR2/HveB；HveA；α-肌营养不良蛋白聚糖；LDLR/α2MR/LRP；PVR；PRR1/HveC、层粘连蛋白受体、101F6、123F2、53BP2、ab1、ABLI、ADP、aFGF、APC、ApoA1、ApoAIV、ApoE、ATM、BAI-1、BDNF、Beta*(BLU)、bFGF、BLC1、BLC6、BRCA1、BRCA2、CBFA1、CBL、C-CAM、CFTR、CNTF、COX-1、CSFIR、CTS-1、胞嘧啶脱氨酶、DBCCR-1、DCC、Dp、DPC-4、E1A、E2F、EBRB2、erb、ERBA、ERBB、ETS1、ETS2、ETV6、Fab、FancA、FancB、FancC、FancDI、FancD2、FancE、FancF、FancG、Fanc1、FancJ、FancL、FancM、FancN、FancO、FancP、FancQ、FancR、FancS、FancT、FancU、FancV、和FancW、FCC、FGF、FGR、FHIT、fms、FOX、FUS1、FUS1、FYN、G-CSF、GDAIF、基因21、基因26、GM-CSF、GMF、gsp、HCR、HIC-1、HRAS、hst、IGF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、ING1、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、IRF-1、JUN、KRAS、LCK、LUCA-1、LUCA-2、LYN、MADH4、MADR2、MCC、mda7、MDM2、MEN-I、MEN-II、MLL、MMAC1、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、neu、NF-1、NF-2、NGF、NOEY1、NOEY2、NRAS、NT3、NT5、OVCA1、p16、p21、p27、p53、p57、p73、p300、PGS、PIM1、PL6、PML、PTEN、raf、Rap1A、ras、Rb、RB1、RET、rks-3、ScFv、scFVras、SEMA3、SRC、TAL1、TCL3、TFPI、血小板反应蛋白、胸苷激酶、TNF、TP53、trk、T-VEC、VEGF、VHL、WT1、WT-1、YES、zac1、艾杜糖苷酶、IDS、GNS、HGSNAT、SGSH、NAGLU、GUSB、GALNS、GLB1、ARSB、HYAL1、F8、F9、HBB、CYB5R3、γC、JAK3、IL7RA、RAG1、RAG2、DCLRE1C、PRKDC、LIG4、NHEJ1、CD3D、CD3E、CD3Z、CD3G、PTPRC、ZAP70、LCK、AK2、ADA、PNP、WHN、CHD7、ORAI1、STIM1、CORO1A、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、RMRP、DKC1、TERT、TINF2、DCLRE1B和SLC46A1。


28.如权利要求8所述的方法，其中所述AuNP还包含连接到所述核酸酶的靶向配体。


29.如权利要求28所述的方法，其中所述具有连接的靶向配体的AuNP的直径为60-150nm。


30.如权利要求28所述的方法，其中所述靶向配体包括结合CD3、CD4、CD34、CD46、CD90、CD133、CD164、促黄体生成激素释放激素(LHRH)受体或芳基烃受体(AHR)的结合分子。


31.如权利要求28所述的方法，其中所述靶向配体包括抗人CD3抗体或其抗原结合片段、抗人CD4抗体或其抗原结合片段、抗人CD34抗体或其抗原结合片段、抗人CD46抗体或其抗原结合片段、抗人CD90抗体或其抗原结合片段、抗人CD133抗体或其抗原结合片段、抗人CD164抗体或其抗原结合片段、抗人CD133适体、人促黄体生成激素、人绒毛膜促性腺激素、醋酸地格瑞克或StemRegenin1。


32.如权利要求28所述的方法，其中所述靶向配体包括抗体克隆：581；抗体克隆：561；抗体克隆：REA1164；抗体克隆：AC136；抗体克隆：5E10；抗体克隆：DG3；抗体克隆：REA897；抗体克隆：REA820；抗体克隆：REA753；抗体克隆：REA816；抗体克隆：293C3；抗体克隆：AC141；抗体克隆：AC133；抗体克隆：7；适体A15；适体B19；HCG(蛋白质/配体)；或促黄体生成激素(LH蛋白质/配体)。


33.如权利要求28所述的方法，其中所述核酸酶和靶向配体通过氨基酸接头连接。


34.如权利要求33所述的方法，其中所述氨基酸接头包括直接氨基酸接头、柔性氨基酸接头或基于标签的氨基酸接头。


35.如权利要求28所述的方法，其中所述核酸酶和靶向配体通过聚乙二醇(PEG)连接。


36.如权利要求28所述的方法，其中所述核酸酶和靶向配体通过胺-巯基交联剂或巯基-巯基交联剂连接。


37.如权利要求28所述的方法，其中所述核酸酶和靶向配体通过PEG和胺-巯基交联剂连接或通过PEG和巯基-巯基交联剂连接。


38.如权利要求28所述的方法，其中所选细胞群体没有经历磁性分离过程以从所述生物样品中除去所述所选细胞。


39.如权利要求8所述的方法，其中所述所选细胞群...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·E·阿达伊尔，R·沙赫巴齐，
申请(专利权)人：弗莱德哈钦森癌症研究中心，
类型：发明
国别省市：美国;US