原位基因编辑制造技术

公开了使用通过病毒(例如，AAV)递送的靶向序列的核酸酶对细胞(例如，干细胞、组织干细胞、肌肉干细胞、骨骼肌中的Sca‑1

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】原位基因编辑相关应用本申请要求2018年8月18日提交的美国临时申请号62/719,628的权益。以上申请的全部教导内容以引用方式并入本文。政府支持本专利技术是根据由美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的授权号F32AG050395、R01HL135287、DP1AG048917和R01AR070825在政府支持下完成的。政府享有本专利技术的某些权利。
技术介绍
身体组织和器官的有效功能发挥取决于适当细胞数目的维持(体内稳态)和损伤后受损细胞的更换(修复)，这两个过程都需要组织干细胞的调控作用。跨越数十年的许多研究试图定义干细胞功能的关键分子调节剂。但是，研究人员能够询问和确定此类介体的速度因产生基因工程化小鼠和通常用于此类研究的干细胞移植模型的技术限制而受约束。特别地，转基因和基于基因敲除的方法需要产生和繁育多个不同的基因工程化缺失和/或夹杂等位基因(floxedallele)，以便以普遍或组织特异性方式破坏目标基因，当干扰若干基因的组合效应引人关注时，这一挑战就会加剧。同样，对干细胞的离体基因组操纵也需要对这些细胞进行分离和移植，这扰乱了内源性干细胞生态位中存在的关键调控相互作用，并会深刻地改变正常干细胞的特性(Wagers,2012)。因此，可编程的体内平台可操纵内源性干细胞中的基因表达而无需对这些细胞进行分离或产生复杂的多等位基因转基因动物，本领域将从中大大受益。当前提出的许多基于CRISPR/cas9的基因修饰治疗方式包括离体方法，其中在修饰之前从患者移除靶细胞群。然而，实体组织不一定能从患者移除，进而限制了这些方法的适用性。此外，移除诸如造血细胞的组织会带来巨大的移植失败和感染风险，并且需要昂贵的GMP设施来处理离体细胞。由于细胞天然生态位和调控相互作用的丧失，组织移除还会破坏组织中的细胞功能发挥。因此，仍然需要原位基因修饰方法，特别是对于不能轻易从受试者体内移除的细胞。
技术实现思路
公开了一种强大的新平台，所述新平台可在细胞的生理生态位内遗传改变细胞，同时保留其天然干细胞特性和调控相互作用。特别地，所述系统允许原位操纵干细胞基因组，而无需进行细胞分离、培养或后续移植，从而保留了天然的调控相互作用和现有的干细胞特性。这种系统还减轻了与离体干细胞修饰和后续移植相关的挑战和毒性，例如体外条件无法维持稳健的干细胞功能，必需使用去髓性预处理，以及移植失败风险不可避免(Morgan等人,2017)。因此，利用DNA修饰酶直接转导内源性组织干细胞的机会与当前正在进行的旨在于干细胞中进行治疗性基因编辑的学术和商业努力有着直接和特定的联系，至此，所有这些都已被考虑在内，有必要纯化干细胞以进行离体修饰和再输注(Morgan等人,2017)。本文所述的基于AAV的体内系统还克服了与当前用于询问干细胞功能的实验系统相关的关键技术和实践限制。特别地，常用的基于转基因和基因敲除的模型经常需要复杂的繁育方案来引入多个等位基因，这需要大量的时间和资源投入，且当评定老年动物中、非标准遗传背景下或组合方式的基因靶向效果时，变得更成问题。相比之下，如本文所公开，AAV介导的可编程的DNA修饰酶递送可应用于一系列动物年龄和品系以及各种单独的和多重的基因座。因此，这项技术可能在加速体内和组织祖细胞中基因功能和相互作用可被询问的速度方面有重要的应用。最终，这种系统可能适用于使得能够对可能特异性地影响干细胞表型的候选和未知基因靶标进行快速的且直接的体内筛查。本公开的一些方面涉及用于在体内修饰受试者中的细胞群的基因组的方法，所述方法包括使所述受试者与病毒接触，其中所述病毒将编码靶向序列的核酸酶的核酸序列转导至所述细胞群中；以及用所述靶向序列的核酸酶修饰所述细胞群的基因组(例如，所述细胞群内的细胞的基因组)，其中所述细胞群不是造血干细胞或造血祖细胞。在一些实施方案中，所述方法对于细胞群是选择性的，或选择性地排除一个或多个其他细胞群(可排除本文公开或本领域已知的任何细胞群)。在一些实施方案中，所述病毒是腺相关病毒(AAV)。在一些实施方案中，所述AAV是AAV血清型1、2、6、8、9、10或Anc80L65。在一些实施方案中，局部或全身地施用所述病毒。在一些实施方案中，静脉内施用所述病毒。在一些实施方案中，局部注射所述病毒(例如，将病毒注射到包含细胞群(即，靶细胞群)的组织中。在一些实施方案中，所述靶向序列的核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Cre重组酶或RNA指导的核酸酶(例如，Cas9核酸酶)。在一些实施方案中，所述靶向序列的核酸酶是Cas9核酸酶。在一些实施方案中，所述病毒在细胞群中进一步转导编码一个或多个gRNA的核酸序列。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述受试者与第二病毒接触，所述第二病毒在细胞群中转导编码一个或多个gRNA的核酸序列。在一些实施方案中，所述第二病毒是AAV。在一些实施方案中，所述AAV是AAV血清型1、2、6、8、9、10或Anc80L65。在一些实施方案中，所述细胞群是干细胞或祖细胞。在一些实施方案中，所述细胞群是组织干细胞(例如，实体组织干细胞)。在一些实施方案中，所述细胞群是功能性肌肉干细胞。在一些实施方案中，所述细胞群是骨骼肌中的Sca-1+间充质祖细胞。在一些实施方案中，所述细胞群是皮肤组织中的真皮间充质细胞(CD140a+)。在本专利技术的一些实施方案中，所述细胞群是祖细胞(例如，造血祖细胞群、普通髓系祖细胞群、粒细胞单核细胞祖细胞群、巨核细胞红细胞祖细胞群、谱系定型红细胞前体细胞群)。在一些实施方案中，所述修饰包括引入或校正突变。在一些实施方案中，所述修饰包括通过同源定向修复校正突变。在一些实施方案中，所述受试者是人类或小鼠。在一些实施方案中，所述细胞群的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更多由所述病毒(例如，第一病毒或第二病毒，或第一病毒和第二病毒两者)转导。在一些实施方案中，所述细胞群的至少40％由所述病毒(例如，第一病毒或第二病毒，或第一病毒和第二病毒两者)转导。本公开的一些方面涉及一种用于在体内修饰受试者中的肌肉干细胞群的基因组的方法，所述方法包括使所述受试者与病毒接触，其中所述病毒将编码靶向序列的核酸酶的核酸序列转导至所述肌肉干细胞群中；以及用所述靶向序列的核酸酶修饰所述肌肉干细胞群的基因组，其中通过静脉内注射将所述病毒施用给所述受试者，并且其中所修饰的肌肉干细胞保留生肌能力。在一些实施方案中，所述病毒在细胞群中进一步转导编码一个或多个gRNA的核酸序列。在一些实施方案中，所述病毒是AAV8或Anc80L65。在一些实施方案中，所述肌肉干细胞群的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或更多由所述病毒转导。在一些实施方案中，所述肌肉干细胞群的至少50％由所述病毒转导。在一些实施方案中，所述靶向序列的核酸酶是锌指核酸酶(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于在体内修饰受试者中的靶向细胞群的基因组的方法，所述方法包括/na.使所述受试者与病毒接触，其中所述病毒将编码靶向序列的核酸酶的核酸序列转导至所述靶向细胞群中；以及/nb.用所述靶向序列的核酸酶修饰所述靶向细胞群的所述基因组，/n其中所述靶向细胞群不是造血干细胞或造血祖细胞。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180818 US 62/719,6281.一种用于在体内修饰受试者中的靶向细胞群的基因组的方法，所述方法包括
a.使所述受试者与病毒接触，其中所述病毒将编码靶向序列的核酸酶的核酸序列转导至所述靶向细胞群中；以及
b.用所述靶向序列的核酸酶修饰所述靶向细胞群的所述基因组，
其中所述靶向细胞群不是造血干细胞或造血祖细胞。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述病毒是腺相关病毒(AAV)。


3.如权利要求2所述的方法，其中所述AAV对于所述靶向细胞群具有趋向性。


4.如权利要求2至3所述的方法，其中所述AAV对于非靶向细胞群具有减少的趋向性或没有趋向性。


5.如权利要求2至4所述的方法，其中AAV是AAV血清型1、2、6、8、9、10或Anc80L65。


6.如权利要求1至5所述的方法，其中静脉内施用所述病毒或将所述病毒局部注射到包含所述靶向细胞群的组织中。


7.如权利要求1至6所述的方法，其中所述靶向序列的核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Cre重组酶或RNA指导的核酸酶。


8.如权利要求7所述的方法，其中所述RNA指导的核酸酶是Cas9核酸酶。


9.如权利要求1至8所述的方法，其中所述病毒在所述细胞群中进一步转导编码一个或多个gRNA的核酸序列。


10.如权利要求1至9所述的方法，所述方法还包括使所述受试者与第二病毒接触，所述第二病毒在所述靶向细胞群中转导编码一个或多个gRNA的核酸序列。


11.如权利要求10所述的方法，其中所述第二病毒是AAV。


12.如权利要求11所述的方法，其中所述AAV对于所述靶向细胞群具有趋向性。


13.如权利要求11至12所述的方法，其中所述AAV对于非靶向细胞群具有减少的趋向性或没有趋向性。


14.如权利要求11至13所述的方法，其中所述AAV是AAV血清型1、2、6、8、9、10或Anc80L65。


15.如权利要求1至14所述的方法，其中所述靶向细胞群是干细胞或祖细胞。


16.如权利要求1至15所述的方法，其中所述靶向细胞群是组织干细胞。


17.如权利要求1至16所述的方法，其中所述靶向细胞群是功能性肌肉干细胞。


18.如权利要求1至16所述的方法，其中所述靶向细胞群是骨骼肌中的间充质祖细胞(Sca-1+)。


19.如权利要求1至16所述的方法，其中所述靶向细胞群是皮肤组织中的真皮间充质细胞(CD140a+)。


20.如权利要求1至16所述的方法，其中所述靶向细胞群是选自普通髓系祖细胞群、粒细胞单核细胞祖细胞群、巨核细胞红细胞祖细胞群、多能祖细胞群和谱系定型红细胞前体细胞群的祖细胞群。


21.如权利要求1至20所述的方法，其中所述修饰包括引入或校正突变。


22.如权利要求1至20所述的方法，其中所述修饰包括通过同源定向修复校正突变。


23.如权利要求1至22所述的方法，其中所述受试者是人类。


24.如权利要求1至22所述的方法，其中所述受试者是小鼠。


25.如权利要求1至24所述的方法，其中所述靶向细胞群的至少40％由所述病毒转导。


26.一种用于在体内修饰受试者中的肌肉干细胞群的基因组的方法，所述方法包括
a.使所述受试者与病毒接触，其中所述病毒将编码靶向序列的核酸酶的核酸序列转导至所述肌肉干细胞群中；以及
b.用所述靶向序列的核酸酶修饰所述肌肉干细胞群的所述基因组，
其中通过静脉内注射将所述病毒施用给所述受试者，并且其中所修饰的肌肉干细胞保留生肌能力。


27.如权利要求26所述的方法，其中所述病毒是AAV8或Anc80L65。


28.如权利要求26至27所述的方法，其中所述病毒在所述细胞群中进一步转导编码一个或多个gRNA的核酸序列。


29.如权利要求26至28所述的方法，其中所述肌肉干细胞群的至少50％由所述病毒转导。


30.如权利要求26至29所述的方法，其中所述靶向序列的核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Cre重组酶或RNA指导的核酸酶。

【专利技术属性】
技术研发人员：艾米·J·韦格斯，吉尔·戈尔茨坦，利欧·王，亚切赫·徐，梅里姆·冈萨雷斯·塞莱罗，
申请(专利权)人：哈佛学院校长同事会，丹娜法伯癌症研究所公司，
类型：发明
国别省市：美国;US