一种硝磺草酮抗性菌株的筛选的方法技术

本发明专利技术的硝磺草酮抗性菌株的筛选的方法，包括以下步骤：步骤一：对表层土壤和下水道污泥的进行采样得到样品，称取2.0g样品加入到添加有2000μmol/L硝磺草酮的50mLMSM培养基中，在30℃，180r/m富集培养5d，得到培养物。本发明专利技术自然界微生物库中存在广泛的各类基因资源，本研究从除草剂污染的土壤中分离筛选到一株硝磺草酮高耐受菌株MST‑5，从中克隆到硝磺草酮抗性基因Sthppd，利用E.coli BL21(DE3)对StHPPD进行了异源表达和纯化，研究了StHPPD对硝磺草酮的抗性，旨在为新型除草剂抗性基因的发掘和应用提供基础材料。

【技术实现步骤摘要】
一种硝磺草酮抗性菌株的筛选的方法
本专利技术涉及硝磺草酮
，具体涉及一种硝磺草酮抗性菌株的筛选的方法。
技术介绍
草甘膦和抗草甘膦作物的组合在农作物转基因领域超过20年的大面积持续应用，对全球范围农田杂草的控制起到了非常大的作用。然而，长期高剂量使用草甘膦造成了严重的环境危害和巨大的选择压力，已经导致了40多种杂草对草甘膦产生了抗药性。草甘膦及其抗性基因替代组合的发掘和应用，是植物转基因领域重要且紧迫的研究任务之一。4-羟基苯丙酮酸双加氧酶抑制剂类除草剂是近年来新开发的一类新型白化型除草剂，其除草机理是通过竞争性抑制植物酪氨酸代谢途径中HPPD的活性，从而使质体醌和生育酚的合成受阻，间接影响了类胡萝卜素的合成和功能，使植物光合作用不能正常进行，导致杂草叶片白化，组织坏死，最终死亡。HPPD抑制剂类除草剂广泛应用于防治玉米田中的阔叶杂草和禾本科杂草，具有环境安全性高、作物安全性好和杂草抗性产生慢等优点，被认为是替代草甘膦的转基因作物靶标除草剂。HPPD抑制剂类除草剂主要品种有硝磺草酮、苯吡唑草酮和异噁唑草酮，其中硝磺草酮是用量最大的一类。目前，巴斯夫和先正达利用来自于燕麦的HPPD突变体AvHPPD-03开发出抗硝磺草酮的转基因大豆SYHT0H2并已进行了商业化生产，而国内仅克隆出了3个抗HPPD基因，尚无高抗硝磺草酮的HPPD基因的报道。基于此，本专利技术提供一种硝磺草酮抗性菌株的筛选的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种硝磺草酮抗性菌株的筛选的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种硝磺草酮抗性菌株的筛选的方法，包括以下步骤：步骤一：对表层土壤和下水道污泥的进行采样得到样品，称取2.0g样品加入到添加有2000μmol/L硝磺草酮的50mLMSM培养基中，在30℃，180r/m富集培养5d，得到培养物；步骤二：然后将5mL培养物转移到50mL新鲜的MSM培养基中，继续培养5d，经过连续富集驯化5轮后，吸取1mL上清培养液并稀释涂布于TMSM平板上，挑取在平板上生长的单菌落反复划线，获得纯培养物，并经革兰氏染色法筛选获得其中的阴性菌；步骤三：纯化得到的革兰氏阴性菌株转接至含有500μmol/L硝磺草酮的TMSM平板上，挑取能在平板上生长的菌株，然后转接到新的筛选平板上，转接过程中逐渐增加筛选平板上硝磺草酮的浓度以增加选择压力，最终筛选出硝磺草酮高度耐受菌株；步骤四：以硝磺草酮高度耐受菌株基因组DNA为模板，根据引物对pET-Sthppd-F/pET-Sthppd-R，PCR扩增其hppd基因，对PCR产物进行回收纯化，然后利用同源重组的方式克隆至线性化的pET-29a(+)载体，构建好的pET-Sthppd表达载体转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，StHPPD重组蛋白在16℃、160r/m摇床中过夜诱导表达，利用Co2+柱进行蛋白纯化；步骤五：将纯化的硝磺草酮抗性菌株进行筛选处理。优选地，所述MSM培养基的组分包括以下重量份原料：NaCl0.5-1.0g/L，NH4Cl0.5-1.0g/L，KH2PO40.3-0.7g/L，K2HPO41.3-1.7g/L，MgSO4·7H2O0.1-0.3g/L，加超纯水至1L，并调节pH至7.0。优选地，所述TMSM培养基为MSM培养基添加1g/L的酪氨酸。优选地，所述硝磺草酮抗性菌株筛选的具体步骤为：从采集的土壤样品中共获得了96株能以酪氨酸为唯一碳源生长的细菌，分别编号为MST-1-MST-96，然后将96株菌分别逐渐转接至含有500-5000μmol/L硝磺草酮的TMSM平板上，在500μmol/L低浓度的硝磺草酮作为选择压力时，从中筛选获得了72株菌，在含有5000μmol/L硝磺草酮的TMSM平板上筛选到3株菌株。优选地，所述TMSM平板上筛选到3株菌株分别为MST-5、MST-32和MST-66。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术自然界微生物库中存在广泛的各类基因资源，本研究从除草剂污染的土壤中分离筛选到一株硝磺草酮高耐受菌株MST-5，从中克隆到硝磺草酮抗性基因Sthppd，利用E.coliBL21(DE3)对StHPPD进行了异源表达和纯化，研究了StHPPD对硝磺草酮的抗性，旨在为新型除草剂抗性基因的发掘和应用提供基础材料。附图说明图1为本专利技术菌株MST-5、MST-32和MST-66对硝磺草酮的降解能力的示意图；图2为本专利技术菌落形态图；图3为本专利技术透射电镜照片形态图；图4为StHPPD的SDS-PAG检测图；图5为StHPPD催化4-HPP生成HGA的液相色谱图；图6为温度(a)和pH(b)对StHPPD酶活的影响。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1本实施例的一种硝磺草酮抗性菌株的筛选的方法，包括以下步骤：步骤一：对表层土壤和下水道污泥的进行采样得到样品，称取2.0g样品加入到添加有2000μmol/L硝磺草酮的50mLMSM培养基中，在30℃，180r/m富集培养5d，得到培养物；步骤二：然后将5mL培养物转移到50mL新鲜的MSM培养基中，继续培养5d，经过连续富集驯化5轮后，吸取1mL上清培养液并稀释涂布于TMSM平板上，挑取在平板上生长的单菌落反复划线，获得纯培养物，并经革兰氏染色法筛选获得其中的阴性菌；步骤三：纯化得到的革兰氏阴性菌株转接至含有500μmol/L硝磺草酮的TMSM平板上，挑取能在平板上生长的菌株，然后转接到新的筛选平板上，转接过程中逐渐增加筛选平板上硝磺草酮的浓度以增加选择压力，最终筛选出硝磺草酮高度耐受菌株；步骤四：以硝磺草酮高度耐受菌株基因组DNA为模板，根据引物对pET-Sthppd-F/pET-Sthppd-R，PCR扩增其hppd基因，对PCR产物进行回收纯化，然后利用同源重组的方式克隆至线性化的pET-29a(+)载体，构建好的pET-Sthppd表达载体转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，StHPPD重组蛋白在16℃、160r/m摇床中过夜诱导表达，利用Co2+柱进行蛋白纯化；步骤五：将纯化的硝磺草酮抗性菌株进行筛选处理。本实施例的MSM培养基的组分包括以下重量份原料：NaCl0.5-1.0g/L，NH4Cl0.5-1.0g/L，KH2PO40.3-0.7g/L，K2HPO41.3-1.7g/L，MgSO4·7H2O0.1-0.3g/L，加超纯水至1L，并调节pH至7.0。本实施例的TMSM培养基为MSM培养基添加1g/L的酪氨酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种硝磺草酮抗性菌株的筛选的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤一：对表层土壤和下水道污泥的进行采样得到样品，称取2.0g样品加入到添加有2000μmol/L硝磺草酮的50mL MSM培养基中，在30℃，180r/m富集培养5d，得到培养物；/n步骤二：然后将5mL培养物转移到50mL新鲜的MSM培养基中，继续培养5d，经过连续富集驯化5轮后，吸取1mL上清培养液并稀释涂布于TMSM平板上，挑取在平板上生长的单菌落反复划线，获得纯培养物，并经革兰氏染色法筛选获得其中的阴性菌；/n步骤三：纯化得到的革兰氏阴性菌株转接至含有500μmol/L硝磺草酮的TMSM平板上，挑取能在平板上生长的菌株，然后转接到新的筛选平板上，转接过程中逐渐增加筛选平板上硝磺草酮的浓度以增加选择压力，最终筛选出硝磺草酮高度耐受菌株；/n步骤四：以硝磺草酮高度耐受菌株基因组DNA为模板，根据引物对pET-Sthppd-F/pET-Sthppd-R，PCR扩增其hppd基因，对PCR产物进行回收纯化，然后利用同源重组的方式克隆至线性化的pET-29a(+)载体，构建好的pET-Sthppd表达载体转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，StHPPD重组蛋白在16℃、160r/m摇床中过夜诱导表达，利用Co2+柱进行蛋白纯化；/n步骤五：将纯化的硝磺草酮抗性菌株进行筛选。/n...

【技术特征摘要】
1.一种硝磺草酮抗性菌株的筛选的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：对表层土壤和下水道污泥的进行采样得到样品，称取2.0g样品加入到添加有2000μmol/L硝磺草酮的50mLMSM培养基中，在30℃，180r/m富集培养5d，得到培养物；
步骤二：然后将5mL培养物转移到50mL新鲜的MSM培养基中，继续培养5d，经过连续富集驯化5轮后，吸取1mL上清培养液并稀释涂布于TMSM平板上，挑取在平板上生长的单菌落反复划线，获得纯培养物，并经革兰氏染色法筛选获得其中的阴性菌；
步骤三：纯化得到的革兰氏阴性菌株转接至含有500μmol/L硝磺草酮的TMSM平板上，挑取能在平板上生长的菌株，然后转接到新的筛选平板上，转接过程中逐渐增加筛选平板上硝磺草酮的浓度以增加选择压力，最终筛选出硝磺草酮高度耐受菌株；
步骤四：以硝磺草酮高度耐受菌株基因组DNA为模板，根据引物对pET-Sthppd-F/pET-Sthppd-R，PCR扩增其hppd基因，对PCR产物进行回收纯化，然后利用同源重组的方式克隆至线性化的pET-29a(+)载体，构建好的pET-Sthppd表达载体转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，StHPPD重组蛋白在16℃、160r/m摇床中过夜诱导表达，利用Co2+柱进行蛋白纯化；
步骤五：...

【专利技术属性】
技术研发人员：张磊，丁浩然，杨猷建，牛冬冬，
申请(专利权)人：盐城金苗农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32