本发明专利技术提供一种基于液质联用的α‑淀粉酶抑制剂的评估方法，该方法利用液质联用检测α淀粉酶酶促反应产物进而详尽、准确地反映α淀粉酶活性。本发明专利技术可以更加精细的测定α‑淀粉酶催化淀粉水解产生的所有产物，从而更为真实的量化酶促反应过程。本发明专利技术可对酶抑制剂研制提供更可靠依据；同时本发明专利技术可以避免在开发具有还原性以及荧光的抑制剂对于传统测定方法的干扰。
【技术实现步骤摘要】
一种基于液质联用的α-淀粉酶抑制剂的评估方法
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种基于液质联用的α-淀粉酶抑制剂的评估方法及应用。
技术介绍
餐后血糖的管理是糖尿病治疗和预防的重要方面。其中，抑制人体肠道中的α-淀粉酶活性进而降低由食物中淀粉向葡萄糖的转化，已经是治疗糖尿病的一种临床常用方法。因此如何高效、快速、精准的开发对于α-淀粉酶具有抑制活性的抑制剂，也一直是相关领域的研究热点。目前几乎所有的α-淀粉酶抑制剂开发都依赖于对酶活性的测定。一般来说，通过测定体外酶活反应体系最终的酶促反应的产物的量，进而反应酶的活力水平；并通过添加抑制剂，与对照组进行比较，评估抑制剂的抑制效果。目前常用的体外酶活测定方法方法有两大类，分别是还原糖测定法和人造底物法。还原糖测定法是直接使用淀粉作为酶促反应的底物，酶促反应之后，通过各种显色的方法，如DNS或GOPOD法测定产物中还原糖的量，间接的反应酶活力水平。人造底物法是使用人工合成的改性淀粉，在淀粉链上连接荧光或者具有紫外吸收的基团，在酶水解这类底物的时候，通过检测到荧光或具有紫外吸收的基团从淀粉链中释放速率，进而反应没活力水平。但是这两类方法均存在一个弊端，既α-淀粉酶对于淀粉的水解，会产生包括聚合度在2至10不等的麦芽糖多聚物，这两大类方法都无法测定每一种产物具体的量，因此不能准确反映酶消化淀粉的真实过程，最终测得的仅仅是酶消化淀粉的一个表观形象。其次，还原糖法还有一个致命缺陷，就是当测试的酶的抑制剂具有还原性时，往往会导致测试结果的强烈干扰，以至于无法准确评价抑制剂的效果。人造底物法存在的重大缺陷是，其使用的是人工合成的底物，并不能准确、真实的反应酶催化淀粉水解的过程，而是一种近似的模拟。因此，现有技术中目前仍需要探索新的适于α-淀粉酶检测的方法，有鉴于此，提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是寻求一种客观、准确的适于α-淀粉酶检测的方法基于液质联用的α-淀粉酶抑制剂的评估方法。为实现上述目的，本专利技术使用液质联用技术，使用天然淀粉作为酶促反应底物，直接从酶促反应体系中将所有聚合度的反应产物进行分离，然后通过质谱直接对各个产物进行定量。从而真实、客观、详尽的反应α-淀粉酶催化淀粉水解的过程。相较于传统方法仅能通过测定酶促反应产物还原性末端的总量或释放的荧光基团和紫外发色基团的总量而间接反映酶活的根本原理不同的是，本专利技术可以直接准确定量所有酶促反应产物的量，相较于传统方法在精细度上达到新的高度。同时，本专利技术还可以避免人造底物作为测定酶活反应所导致的失真；并且，由于前端色谱技术的加持，又可以避免在评价还原性抑制剂时产生的干扰。本专利技术首先提供一种基于液质联用的α-淀粉酶抑制剂的评估方法，包括如下步骤：步骤1)样品处理：取经α-淀粉酶催化反应后样本，用甲醇、乙醇或者乙腈进行稀释，过滤后制备上样样本；步骤2)液相分离：使用基于亲水作用的色谱柱进行分离，其中流动相为有机相和水相，所述有机相为乙腈、甲醇或乙醇，所述水相为甲酸铵或乙酸铵溶液；步骤3)质谱检测：利用低分辨或高分辨质谱进行检测；步骤4)数据处理：对数据进行绝对定量和/或相对定量处理。进一步的，所述步骤1)中，采用与样本等体积的甲醇、乙醇或者乙腈进行稀释；所述过滤采用滤膜过滤，所述滤膜采用0.1-0.45μm的滤膜过滤；优选的采用0.22μm滤膜过滤；进一步的，所述步骤2)中色谱柱包括但不限于CapcellCorePC色谱柱或Accucore150-Amide-HILIC色谱柱；在一些实施方式中，所述色谱柱包括但不限于CapcellCorePC色谱柱(2.1×50mm，2.7μM)或Accucore150-Amide-HILIC色谱柱(2.1×50mm，2.6μM)；所述色谱柱的柱温设置40℃。进一步的，所述步骤2)中水相中甲酸铵浓度为1-5mM，优选的为1mM；所述水相中乙酸铵浓度1-5mM，优选的为5mM。进一步的，所述步骤2)中水相比例为10-50％，优选的为25-40％，更优选的为30-37％；所述流动相的流速0.3-1mL/min,优选的为0.3mL/min。进一步的，所述步骤3)中检测为检测样本中麦芽糖(G2)、麦芽三糖(G3)、麦芽四糖(G4)、麦芽五糖(G5)、麦芽六糖(G6)、麦芽七糖(G7)、麦芽八糖(G8)麦芽九糖(G9)和麦芽十糖(G10)中至少三个、四个、五个、六个、七个、八个或全部。进一步的，所述步骤3)中所述质谱离子源为电喷雾离子源(ESI)，包括但不限于JetStreamTechnologyESI或HESI；优选的，所述质谱的源电压设置在3.5-5.5kV之间，源温度设置在350-550℃之间，鞘气设置在30-50mL/min之间，辅助气设置为10mL/min。进一步的，所述步骤4)中所述绝对定量使用麦芽糖(G2)、麦芽三糖(G3)、麦芽四糖(G4)、麦芽五糖(G5)、麦芽六糖(G6)、麦芽七糖(G7)、麦芽八糖(G8)麦芽九糖(G9)和麦芽十糖(G10)中至少三个、四个、五个、六个、七个、八个或全部。做外标曲线，所有检测产物使用峰面积与浓度进行拟合，优选的为线性拟合；所述相对定量用测试组的产物峰面积与对照组做比值计算。本专利技术还提供一种基于液质联用的α-淀粉酶抑制剂的评估中的应用。进一步的，所述应用通过检测α淀粉酶酶促产物量来检测α淀粉酶的活性，所述产物包括麦芽糖(G2)、麦芽三糖(G3)、麦芽四糖(G4)、麦芽五糖(G5)、麦芽六糖(G6)、麦芽七糖(G7)、麦芽八糖(G8)麦芽九糖(G9)和麦芽十糖(G10)中至少三个、四个、五个、六个、七个、八个或全部。更进一步的，通过上述具体方法进行评估。本专利技术还提供一种用于液质联用试剂在制备α-淀粉酶抑制剂评估的检测试剂中的应用。本专利技术还提供一种α-淀粉酶抑制剂评估的检测试剂，其特征在于，所述试剂包括液相色谱分离试剂和质谱检测试剂，所述液相色谱分离试剂中包括乙腈、甲醇或乙醇的有机相，和甲酸铵或乙酸铵溶液的水相；所述质谱检测试剂能够用于麦芽糖(G2)、麦芽三糖(G3)、麦芽四糖(G4)、麦芽五糖(G5)、麦芽六糖(G6)、麦芽七糖(G7)、麦芽八糖(G8)麦芽九糖(G9)和麦芽十糖(G10)中至少三个、四个、五个、六个、七个、八个或全部。的检测。与现有技术相比，本专利技术至少具有如下优势：1)本专利技术提供一种全新的α-淀粉酶抑制剂的评估方法，该方法可以更加准确的反映α-淀粉酶催化淀粉水解的真实过程，从而可以对于酶抑制剂的开发提供更可靠的依据。传统的方法普遍只能反应酶促反应以及酶的抑制剂作用的宏观情况，而无法确定抑制剂对于酶的每一种产物的抑制作用。因此在用这些方法开发抑制剂的时候，无法确定抑制剂究竟降低了哪种产物的量。本专利技术可以直接测定每一种酶促反应产物的量，进而精细的勾勒酶促反应过程。用本方法用于α-淀粉酶抑制剂开发的时候，可以更好地判断抑制剂对于具体酶促反应产物的抑制作用。2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于液质联用的α-淀粉酶抑制剂的评估方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤1)样品处理：取经α-淀粉酶催化反应后样本，甲醇、乙醇或乙腈稀释，过滤后制备上样样本；/n步骤2)液相分离：使用基于亲水作用的色谱柱进行分离，其中流动相为有机相和水相，所述有机相为乙腈、甲醇或乙醇，所述水相为甲酸铵或乙酸铵溶液；/n步骤3)质谱检测：利用低分辨或高分辨质谱进行检测；/n步骤4)数据处理：对数据进行绝对定量和/或相对定量处理。/n
【技术特征摘要】
1.一种基于液质联用的α-淀粉酶抑制剂的评估方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1)样品处理：取经α-淀粉酶催化反应后样本，甲醇、乙醇或乙腈稀释，过滤后制备上样样本；
步骤2)液相分离：使用基于亲水作用的色谱柱进行分离，其中流动相为有机相和水相，所述有机相为乙腈、甲醇或乙醇，所述水相为甲酸铵或乙酸铵溶液；
步骤3)质谱检测：利用低分辨或高分辨质谱进行检测；
步骤4)数据处理：对数据进行绝对定量和/或相对定量处理。
2.权利要求1所述的基于液质联用的α淀粉酶的活性检测方法，其特征在于，所述步骤3)中检测为检测样本中麦芽糖(G2)、麦芽三糖(G3)、麦芽四糖(G4)、麦芽五糖(G5)、麦芽六糖(G6)、麦芽七糖(G7)、麦芽八糖(G8)麦芽九糖(G9)和麦芽十糖(G10)中至少三个、四个、五个、六个、七个、八个或全部。
3.权利要求1-2任一所述的基于液质联用的α-淀粉酶抑制剂的评估方法，其特征在于，所述步骤2)中色谱柱包括但不限于CapcellCorePC色谱柱或Accucore150-Amide-HILIC色谱柱；优选的，所述色谱柱包括但不限于CapcellCorePC色谱柱(2.1×50mm，2.7μM)或Accucore150-Amide-HILIC色谱柱(2.1×50mm，2.6μM)；更优选的，所述色谱柱的柱温设置40℃。
4.权利要求1-3任一所述的基于液质联用的α-淀粉酶抑制剂的评估方法，其特征在于，所述步骤2)中水相中甲酸铵浓度为1-5mM，优选的为1mM；所述水相中乙酸铵浓度1-5mM，优选的为5mM。
5.权利要求1-4任一所述的基于液质联用的α-淀粉酶抑制剂的评估方法，其特征在于，所述步骤2)中水相比例为25-40％，优选的，水相比例为30-37％；所述流动相的流速0.3-1mL/min。
6.权利要求1-5任一...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖郑操，岳田利，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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