一种烟草青枯病的SNP分子标记、其获得方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种烟草青枯病的SNP分子标记、其获得方法及其应用，烟草青枯病的SNP分子标记，序列为SEQ ID NO.1，SNP分子标记的序列自5’端起第234位碱基为SNP位点n；n为A或G；SNP分子标记用于烟草青枯病抗性的检测：对待检烟草样本DNA进行PCR扩增；扩增产物经

【技术实现步骤摘要】
一种烟草青枯病的SNP分子标记、其获得方法及其应用
本专利技术涉及一种烟草青枯病的SNP分子标记、其获得方法及其应用，属于分子生物学

技术介绍
青枯病是一种由青枯菌引起的细菌性病害，是典型的维管束病害，一旦发病会导致作物全株枯萎死亡，给农业生产造成毁灭性打击。烟草青枯病在我国南方各大烟区广泛影响烟草生长，严重导致烟叶产量和品质下降，是目前烟草种植最重要的病害之一。但迄今仍未找到有效的防治方法。烟草青枯病抗性属于数量性状遗传，受多基因共同控制，且易受到环境影响，所以传统地常规育种效率低下。烟草工业生产过程中，涉及的配方及工艺流程，一般不会轻易发生改变。因此，在不改变主栽品种基本农艺性状的前提下，需要对主栽品种的抗青枯病性状进行定向改良，避免后期影响工业生产流程，提升效益。选育青枯病品种，首先要有良好的抗源，目前青枯病抗源来源十分狭窄，现今国内烟草青枯病的抗源主要是从普通烟草品种Ti448（美国发现抗源品种）选育而来，但其抗性仍不稳定，需要进一步的研究。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一种烟草青枯病的SNP分子标记，可在植株营养生长早期鉴别其抗性，因而可直接用于烟草抗青枯病辅助育种工作。本专利技术的第二个目的在于提供上述烟草青枯病的SNP分子标记的获得方法，采用新的品种作为抗源，丰富青枯病的抗性遗传基础，加快抗青枯病新基因在抗病育种中的转移和利用。本专利技术的第三个目的在于提供一种引物。本专利技术的第四个目的在于提供上述烟草青枯病的SNP分子标记的应用，该标记完全基于与青枯病性状共分离，用其检测不存在假阳性的问题。实现本专利技术的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种烟草青枯病的SNP分子标记，SNP分子标记的序列为SEQIDNO.1，SNP分子标记的序列自5’端起第234位碱基为SNP位点n；n为A或G。实现本专利技术的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种烟草青枯病的SNP分子标记的获得方法，包括：材料选择步骤：烟草品种GDSY为抗源，以烤烟品种K326或云烟87为受体，得到F1后，通过连续回交与表型选择相结合的方法构建抗病近等基因系群体；酶切位点识别步骤：采用BSA分析法进行青枯病抗性基因的定位工作，将候选基因定位在14.6Mb区间内，筛选均匀分布的150个SNP位点，位点间平均距离100Kb，设计引物并采用多重PCR进行扩增与测序验证，根据基因型结果和表型进行关联分析，区间里含有唯一候选SNP位点落入生长素转运蛋白基因的外显子区域，造成氨基酸的非同义突变，得到SNP分子标记，序列为SEQIDNO.1；SNP分子标记自5’端起第234位碱基为SNP位点n，为XhoΙ酶切位点，n为A或G。进一步地，抗病近等基因系群体中选用烟草的幼嫩叶片进行DNA提取，然后进行BSA分析法。实现本专利技术的第三个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种引物，引物用于烟草青枯病抗性的检测；正向引物SEQIDNO.2：5’-TCTACCTCCCAGACTTCACT-3’；反向引物SEQIDNO.3：5’-CCACTTGTAGAACTGGCTAT-3’。实现本专利技术的第四个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种烟草青枯病的SNP分子标记的应用，用于烟草青枯病抗性的检测。进一步地，对待检烟草样本DNA进行PCR扩增；扩增产物经XhoΙ酶切后进行电泳，产生362bp和231bp两条带为抗病纯合植株，产生593bp、362bp和231bp三条带为抗病杂合植株，产生593bp一条带为感病纯合植株；PCR扩增的引物为正向引物SEQIDNO.2：5’-TCTACCTCCCAGACTTCACT-3’；反向引物SEQIDNO.3：5’-CCACTTGTAGAACTGGCTAT-3’。进一步地，PCR扩增前，对待检烟草样本DNA加入ddH2O后，进行95℃预变性10min，立即插入冰上淬火3min，再进行PCR扩增。进一步地，PCR反应体系包括DNA模板、2×EsTaqMasterMix、正向引物、反向引物、ddH2O和DMSO。进一步地，PCR反应体系为20µL：包括1.5µLDNA模板，10µL2×EsTaqMasterMix，正向反向引物各1µL，ddH2O4.5µL，2µLDMSO。进一步地，DMSO的浓度为10v/v%。进一步地，PCR扩增的程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸5min。本专利技术在基于前期大规模作物种质资源青枯病抗性评价过程中，发现烟草（NicotianatabacumL.）种质GDSY对青枯病具有显著高水平优良抗性，经遗传研究发现其抗性为显性遗传。进一步经过多年的接菌实验及其田间鉴定，再次验证GDSY种质对青枯菌有优异的抗病性，具有较高的遗传利用价值。抗病遗传与美国抗青枯病品种（Ti448A为抗源）不同，为新型抗源且抗性优于美国抗源。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：1、本专利技术烟草青枯病的SNP分子标记其获得方式和应用操作简单可靠，经济高效，可在植株营养生长早期鉴别其抗性，因而可直接用于烟草抗青枯病辅助育种工作，对于烟草青枯病抗性育种具有重要应用价值；2、本专利技术烟草青枯病的SNP分子标记是一个基于PCR技术与酶切的共显性标记，跟RFLP、AFLP等标记相比，可显著降低成本，节省劳力；另外，该标记完全基于与青枯病性状共分离，用其检测不存在假阳性的问题；将该标记完全应用于苗期选择，不仅可以减少工作量，而且能够避免因接种不充分，或者田间生长不确定性，难以准确筛选出具有抗病基因的个体植株，从而加速育种进程；3、本专利技术烟草青枯病的SNP分子标记的获得采用新的品种作为抗源，丰富青枯病的抗性遗传基础，加快抗青枯病新基因在抗病育种中的转移和利用；4、本专利技术烟草青枯病的SNP分子标记的作用机制有别于常规的抗病生物学机制，常规的抗病学的解释为茉莉酸JA和水杨酸SA两种激素途径参与调控植物抗病性，而本专利技术基于品种GDSY携带的新基因，参与生长素途径而响应青枯病菌，作用机理有进一步的研究。附图说明图1为实施例2PCR扩增条带；图2为实施例2酶切条带；图3为实施例3抗病纯合产物扩增条带；图4为实施例3感病纯合产物扩增条带；图5为实施例3抗病杂合产物扩增条带。图6为对比例的扩增条带。具体实施方式下面，结合附图以及具体实施方式，对本专利技术做进一步描述：一种烟草青枯病的SNP分子标记的获得方法，包括：材料选择步骤：烟草品种GDSY为抗源，以烤烟品种K326或云烟87为受体，得到F1后，通过连续回交与表型选择相结合的方法构建抗病近等基因系群体；酶切位点识别步骤：选用烟草的幼嫩叶片进行DNA提取，烟草叶片不同于其它作物，成熟叶片含有大量油分，烟碱以及其他化合物成分，所以，在采集烟叶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种烟草青枯病的SNP分子标记，其特征在于所述SNP分子标记的序列为SEQ IDNO.1，SNP分子标记的序列自5’端起第234位碱基为SNP位点n；所述n为A或G。/n

【技术特征摘要】
1.一种烟草青枯病的SNP分子标记，其特征在于所述SNP分子标记的序列为SEQIDNO.1，SNP分子标记的序列自5’端起第234位碱基为SNP位点n；所述n为A或G。


2.一种引物，其特征在于，所述引物用于烟草青枯病抗性的检测；
正向引物SEQIDNO.2：5’-TCTACCTCCCAGACTTCACT-3’；反向引物SEQIDNO.3：5’-CCACTTGTAGAACTGGCTAT-3’。


3.一种烟草青枯病的SNP分子标记的应用，其特征在于，对待检烟草样本DNA进行PCR扩增；扩增产物经XhoΙ酶切后进行电泳，产生362bp和231bp两条带为抗病纯合植株，产生593bp、362bp和231bp三条带为抗病杂合植株，产生593bp一条带为感病纯合植株；
PCR扩增的引物为正向引物SEQIDNO.2：5’-TCTACCTCCCAGACTTCACT-3’；反向引物SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘晓英，张振臣，陈俊标，徐婷裕，袁清华，陈博文，马柱文，李集勤，黄振瑞，
申请(专利权)人：广东省农业科学院作物研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44